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用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域...
预印本（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此版本的版权所有者于 2020 年 11 月 9 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.11.09.371237 doi：bioRxiv 预印本
用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
嗜热菌 Cas9 的 HNH 核酸酶中静电接触的破坏会重新连接变构运动并增强高温 DNA 裂解
多结构域蛋白内的变构信号传导是空间上相距较远的功能位点之间通信的驱动因素。了解大型多结构域蛋白中变构耦合的机制是实现系统空间和时间控制的最有希望的途径。最近，CRISPR-Cas9 在分子生物学和医学领域的应用激增，这促使人们需要了解 Cas9 的原子级蛋白质动力学（这是其变构串扰的驱动力）如何影响其生物物理特性。在本研究中，我们使用核磁共振 (NMR) 和计算的协同方法来精确定位热稳定性 Geo Cas9 的 HNH 结构域中的变构热点。我们表明，K597 突变为丙氨酸会破坏盐桥网络，进而改变 Geo HNH 结构域的结构、变构运动的时间尺度和热稳定性。在广泛研究的中温 S. pyogenes Cas9 中，这种同源赖氨酸到丙氨酸的突变同样改变了 Sp HNH 域的动力学。我们之前已经证明，通过突变改变变构是 Sp Cas9 (e Sp Cas9) 特异性增强的来源。因此，这在 Geo Cas9 中可能也是如此。由 AIP Publishing 独家授权发布。https://doi.org/10.1063/5.0128815
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关 9 (CRISPR/Cas9) 酶的三种工程化 HNH 内切酶 Lys-to-Ala 突变体动力学降低的结构基础
许多细菌对入侵的噬菌体或质粒具有 II 型免疫力，称为成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 9 (Cas9) 系统，用于检测和降解外来 DNA 序列。Cas9 蛋白有两个负责双链断裂的核酸内切酶（分别称为 HNH 结构域，用于切割 DNA 双链的靶链，RuvC 结构域用于切割非靶链）和一个单向导 RNA (sgRNA) 结合结构域，其中 RNA 和靶 DNA 链是碱基配对的。三种工程化的单 Lys-to-Ala HNH 突变体（K810A、K848A 和 K855A）表现出对靶 DNA 链切割的增强的底物特异性。我们在本研究中报告，在野生型酶中，在 1mM EDTA 存在下，与催化位点相邻的含 Y836 环（包括 E827-D837）内的 D835、Y836 和 D837 具有无法表征的加宽 1 H 15 N NMR 共振，而环中其余残基具有不同程度的加宽 NMR 光谱。我们发现，野生型酶中的该环在分子动力学 (MD) 模拟期间表现出三种不同的构象，而三个 Lys-to-Ala 突变体
利用-QM-MM和分子型模拟 -
图2。DNA，SGRNA和蛋白质相互作用（a）（a）匹配的SPCAS9和（b）MM5-SPCAS9聚焦HNH催化位点和PAM（NGG）区域。（C＆D）显示了匹配的和MM5的不同视图，从而缩放了PAM远端和RUVC区域相互作用。T-DNA，NT-DNA和SGRNA分别为颜色的洋红色，黄色和浅蓝色。SPCAS9，HNH和RUVC的两个核酸酶结构域以白色和深蓝色显示。
建立 CRISPR-Cas9 中的变构机制
变构是蛋白质的基本特性，它调节空间上相距遥远的位点之间的生化信息传递。在这里，我们报告了分子动力学 (MD) 模拟在发现 CRISPR-Cas9 中的变构通讯机制方面的关键作用，CRISPR-Cas9 是一种领先的基因组编辑机制，在医学和生物技术方面具有巨大的前景。MD 揭示了变构如何在 CRISPR-Cas9 功能的至少三个步骤中发挥作用：影响 DNA 识别、介导切割和干扰脱靶活性。发现激活协同 DNA 切割的变构通讯通过连接 HNH 和 RuvC 催化域的 L1/L2 环进行。这些“变构传感器”的识别启发了具有改进特异性的 Cas9 蛋白新变体的开发，为控制 CRISPR-Cas9 活性开辟了一条新途径。讨论的研究还强调了识别叶在催化 HNH 域的构象激活中的关键作用。具体而言，REC3 区域被发现通过感知 RNA:DNA 杂合体的形成来调节 HNH 的动态。REC3 的作用在 DNA 错配的情况下尤其重要。事实上，REC3 对在特定位置含有错配对的 RNA:DNA 杂合体的干扰导致 HNH 锁定在非活性“构象检查点”构象中，从而阻碍脱靶切割。总体而言，MD 模拟建立了 CRISPR-Cas9 变构现象的基本机制，有助于开发新的 CRISPR-Cas9 变体以改进基因组编辑的工程策略。
氨中超快伞状运动的激光诱导电子衍射
实时可视化分子转变需要一种具有 A ˚ ngstr om 空间和飞秒时间原子分辨率的结构检索方法。含氢分子的成像还需要一种对氢核原子位置敏感的成像方法，大多数方法对氢散射的灵敏度相对较低。激光诱导电子衍射 (LIED) 是一种桌面技术，可以以亚 A ˚ ngstr om 和飞秒时空分辨率以及对氢散射的相对高灵敏度对气相多原子分子的超快结构变化进行成像。在这里，我们对孤立氨分子 (NH 3 ) 在强场电离后的伞状运动进行了成像。中性氨分子电离后，氨阳离子 (NH 3 + ) 在约 8 飞秒内经历超快几何转变，从金字塔结构 ( U HNH = 107 ) 变为平面结构 ( U HNH = 120 )。利用 LIED，我们在电离后 7:8 9:8 飞秒内恢复了近平面 ( U HNH = 117 6 5 ) 场修饰 NH 3 + 分子结构。我们测量的场修饰 NH 3 + 结构与使用量子化学从头计算计算出的平衡场修饰结构高度一致。
CRISPR/ CAS系统和目标基因组编辑 div>
GRNA与REC叶的结合会引起一系列构象变化，从而产生完全活化的蛋白质。 当Cas9和GRNA的络合物连接时，靶DNA可以连接。 PI结构域识别PAM区域，然后将GRNA种子序列配对。 nuc-lobe的HNH和RuVC域负责靶DsDNA的裂解。GRNA与REC叶的结合会引起一系列构象变化，从而产生完全活化的蛋白质。当Cas9和GRNA的络合物连接时，靶DNA可以连接。PI结构域识别PAM区域，然后将GRNA种子序列配对。nuc-lobe的HNH和RuVC域负责靶DsDNA的裂解。
靶DNA切割原理及Mg2+在CRISPR–Cas9催化中的作用
作为 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的核心，内切酶 Cas9 可在 DNA 中引入位点特异性断裂。然而，目前仍缺乏改善 Cas9 功能的精确机制信息。本文将多微秒分子动力学、自由能和多尺度模拟与溶液 NMR 和 DNA 裂解实验相结合，以解析靶 DNA 裂解的催化机制。我们表明，活性 HNH 核酸酶的构象与催化 Mg 2+ 紧密相关，揭示了其主要的结构作用。这种活性 Mg 2+ 结合的 HNH 通过分子模拟、溶液 NMR 和 DNA 裂解分析得到一致描述，同时还揭示了催化 H840 的质子化状态受到活性位点突变的强烈影响。最后，从头算 QM(DFT)/MM 模拟和元动力学建立了催化机制，表明催化作用由 H840 激活并由 K866 完成，从而使 DNA 裂解实验合理化。这些信息对于增强 CRISPR-Cas9 的酶功能以改进基因组编辑至关重要。