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Clelland 实验室协议 | iPSC 培养，第 1 页，共 5 页 iPSC 细胞...
培养基中，当细胞仍处于对数生长期时，将其转移到培养基中。一旦细胞接近 100% 汇合，它们就会进入平台期（静止期），其中只有不到 10% 的细胞在活跃分裂，并且细胞更容易受到压力的影响。这种低分裂率使得细胞系难以维持，并且增加了细胞系中随着时间的推移积累不想要的突变的可能性。2. 用基质胶溶液包被六孔板，并在 37°C 下孵育至少 30 分钟。
如何将 IPSC 线路存入欧洲...
• 提高您的机构、研究和 iPSC 系的知名度。将您的细胞系存入 EBiSC，可使您的 iPSC 系和研究结果更加可见，因为这样可以让广大社区都能使用您的 iPSC。您的机构也可通过我们的标准化命名系统得到认可。 • 通过 EBiSC 传播细胞系。该库通过响应要求提供您的细胞系样本的研究人员并完成多项材料转让协议来节省您的时间。完成一次存入过程后，EBiSC 将完成其余工作。 • 备份存储。如果您的低温冷冻机出现故障或您本地持有的库存受到污染，您将有机会要求将您的细胞系样本退回实验室，只需支付运费。 • 保留自我分发的权利。通过您的细胞系存入，您不仅满足了资助机构和期刊共享已发表细胞系的要求，还保留了知识产权，并可以根据需要继续使用和分发它们。 • 与 EBiSC 合作伙伴合作。 EBiSC 由学术、中小企业和大型工业合作伙伴组成。通过成为 EBiSC 细胞系所有者，您将成为 EBiSC 内外未来潜在合作者的推荐人。• 额外的特性数据。EBiSC 将作为细胞系银行和质量控制程序的一部分执行额外的特性，这些数据将与您作为细胞系的存放者共享，以支持您正在进行的研究活动。• 商业授权。通过 EBiSC 传播您的细胞系可增加您的细胞系获得下游应用商业许可的机会，并使谈判和决策过程完全由您自行决定。• 免费访问 EBiSC iPSC 细胞系。对于每个存放的细胞系，您将免费收到 2 个小瓶，可以是 EBiSC 银行后的存放细胞系，也可以是另一个银行的 EBiSC 细胞系。*
放大光化学的放大光化学
摘要：已经开发了基于诱导多能干细胞（IPSC）衍生的运动神经元（MN）的大量体外模型，以研究运动神经元疾病（MNDS）选择性MN变性的潜在原因。例如，球体是简单的3D模型，具有大量生成的潜力，可以在不同的测定中使用。在这项研究中，我们生成了MN球体，并开发了一种工作流以分析它们。开始，通过开发管道来获得其大小和形状的测量，可以实现球体的形态学填充。接下来，我们分别通过QPCR和组织清除样品的免疫细胞化学来确认不同Mn标记在转录本和蛋白质水平上的表达。最后，我们评估了Mn球体使用微电极阵列方法以动作电位和突发形式显示功能活动的能力。尽管大多数细胞都表现出MN身份，但我们还表征了其他细胞类型的存在，即中间神经元和少突胶质细胞，它们与MN共享相同的神经祖细胞池。总而言之，我们成功地开发了一种MN 3D模型，并优化了可以应用其形态学，基因表达，蛋白质和功能性培养的工作流，随着时间的流逝。
IPSC衍生的小胶质细胞的转录表征...
小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，在驱动神经炎症（神经退行性疾病的标志）中起关键作用。可诱导的小胶质细胞样细胞已被开发为用于分子和治疗假说产生和测试的体外平台。然而，没有系统地评估这些细胞与原代人小胶质细胞的相似性以及它们对大脑原代细胞期望的外部提示的反应。在这项研究中，我们通过散装和单细胞RNA测序对市售人类诱导的多能干细胞（IPSC）衍生的小胶质细胞（IPSC）细胞进行了转录表征，以评估其与原发性人类小胶质细胞的相似性。为了评估其刺激反应性，用肝X受体（LXR）途径激动剂处理IMGL细胞及其以散装和单细胞RNA测序为特征的转录反应。批量转录组分析表明，IMGL细胞具有与新鲜分离的人类原代小胶质细胞相似的总体表达谱，并表达许多关键的小胶质细胞转录因子以及功能和疾病相关的基因。值得注意的是，在单细胞水平上，IMGL细胞表现出不同的转录亚群，代表了正常和患病的原发性小胶质细胞中存在的稳态和激活状态。用LXR途径对IMGL细胞进行处理，激动剂会诱导脂质代谢和细胞周期的牢固转录变化。在单细胞水平上，我们观察到稳态和活化状态和激活状态的细胞亚群之间的响应异质性以及反应散装的表达会变化为其相应的单细胞态。总之，我们的结果表明，IMGL细胞表现出复杂的转录曲线和反应性，让人联想到体内小胶质细胞，因此代表了神经变性中治疗性发育的有希望的模型系统。
诱导多能干细胞（IPSC）
自2006年以来，开发了一种与自然隔离的PSC非常相似的新技术，它被开发出来，以消除从胚胎的内部细胞质量中获得这些细胞的需求，从而在此过程中破坏胚胎。这意味着现在可以使用大量的PSC，而无需牺牲胚胎以获取它们。iPSC是通过重新工程重新工程的成熟非柔韧性细胞的DNA基因（例如成纤维细胞）的DNA基因，具有多能力的能力。这是通过向载体（例如提供干细胞相关基因的病毒）来实现的。1 IPSC是2007年首次由人类生产的。2此过程中的危险是触发癌基因的触发，如果这些癌基因在人类中使用，可能会触发癌性生长。在2008年，开发了一种更好的方法，其中使用腺病毒代替逆转录病毒作为向量转化人类细胞的载体，这种方法消除了腺病毒的风险，因为腺病毒没有将其任何基因传递给人类宿主。3在2009年开发了一种构成人IPSC的程序，即通过在靶细胞中直接递送蛋白质来消除使用载体的使用，而蛋白质足以诱导多能性。4这种方法的效率仍然很差。
用于疾病研究的 EBiSC iPSC 库
欧洲诱导多能干细胞库 (EBiSC) 是一个非营利性机构，用于储存、银行、质量控制 (QC) 和随后分发研究级人类诱导多能干细胞 (iPSC) 系，该机构集中了国际上在 35 多个疾病领域生成的 iPSC 系，并通过 EBiSC 目录将其提供给用户，供研究使用 (cells.ebisc.org/)。在购买之前，可以访问全面的数据集，其中详细说明了原始组织样本的疾病背景、iPSC 重编程的背景和细胞系特征数据。EBiSC 还执行严格的 QC 筛选，以确保提供可靠、特征明确的 iPSC 系，符合 ISO9001:2015 原则。特定 iPSC 系的全基因组测序数据可从欧洲基因组档案库下载，但须向 EBiSC 数据访问委员会提出申请。 EBiSC 访问和使用协议需要在发货前填写，可从网站下载，同时下载特定的细胞系信息包；这些文件共同阐明了如何使用 EBiSC 细胞系进行研究，并详细说明了可能适用的任何特定第三方义务和/或使用限制。还提供了有关如何培养和监测 iPSC 细胞系（包括实施常规细胞系筛选）的协议。第二个项目阶段将继续收集国际上生成的 iPSC 细胞系，使用改进的自动化策略提供 iPSC 衍生的差异化产品以进行升级，并开发 EBiSC 提供的现有服务，包括 iPSC 重编程、基因编辑和特性描述。
IPSC重新编程的自动有效解决方案
使用标准制造商的建议制备了200μm的单层细胞阵列。用1％Geltrex™涂有6孔板的单个孔和CellRaft阵列（Gibco™Cat。编号A1413301）在37°C下过夜，准备细胞播种。在电穿孔之前，将成纤维细胞培养基分配到每个井/储层中。电穿孔后立即将电穿孔的成纤维细胞重悬于1ML的成纤维细胞培养基中，然后再滴入预先涂层的6孔板和蜂窝阵列中。在第一天，成纤维细胞培养基被补充的N2B27培养基取代，该培养基补充了新鲜的基本成纤维细胞生长因子（BFGF）（Thermo Scientific Cat。编号phg0264）。从D1-D15中，使用补充新鲜BFGF的N2B27培养基每隔一天进行一次完整的培养基变化。在D16上，N2B27培养基被Essential 8™培养基取代（Gibco Cat。编号A1517001），将细胞培养为IPSC。
具有高质量的人IPSC控制线
来自SCTI003-A细胞系的代表性图像。（a）Stemcell的HIPSC可以与肠球形区分开，并使用STEMDIFF™肠类动物试剂盒（目录＃05140）嵌入Matrigel®Domes中，以使其成熟到人肠癌中。可以使用STEMDIFF™肠杆菌生长培养基（目录＃05145）来传递和扩展成熟的类器官（在第13天显示）。（b）使用STEMDIFF™背前桥式分化试剂盒（Catalog＃08620）（CatalDiff＃08620），可以与SCTI003-A区分开染色的DAPI（蓝色），MAP2（MAP2（MAGENTA），NEUN（黄色）和GFAP（CYAN）的神经器官，并与SCTI003-A区分开，并维持STEMDIFF™Neural Organid Organid Organid Organid Orancecodeandenceant（Catean）。（c）hipsc衍生的小胶质细胞具有可见过程和较小的细胞质与核比率，可以通过造血祖细胞中间人使用STEMDIFF™造血量™造血™造血™造血基因（使用Catalog＃05310），从而从Stemcell的HIPSC通过造血祖细胞中间产生（catalog＃05310），并使用Stemdiff™microgiriation（Catalog＃05310），并使用Stemdiff™MicrogliAD（catalog＃05310）（Catalog＃05310）。 ＃100-0019/100-0020）。（d）使用STEMDIFF™心室心肌细胞分化试剂盒（目录＃05010），可以从SCTI003-A产生心室心肌细胞的单层培养。
生成Zeb2不足的人IPSC线（...
智力残疾，癫痫，赫希斯普朗氏病和各种先天性畸形（Garavelli and Mainardi，2007年）。此外，Zeb2的过表达与不同形式的癌症的进展有关（Fardi等，2019）。虽然已经对Zeb2蛋白的功能进行了广泛的研究，但目前缺乏可用的Zeb2缺乏的人类细胞模型，无法在胚胎发育过程中进一步删除Zeb2依赖性调节网络，并且可以取消抗癌药物的发展。为此，我们使用CRISPR/CAS9介导的编辑系统生成了人类IPSC线，耗尽了Zeb2蛋白（表1）。我们分别应用了两个靶向Zeb2外显子5和外显子6的GRNA（图1 a），在父母IPSC线上Kicri002a（表1;（Uhlin等，2017）。通过LiPofection将包含两个GRNA的构建体引入IPSC系，并通过荧光激活的细胞分选（FACS）选择转染的细胞以表达绿色荧光蛋白。单细胞克隆在LN521上扩展，并通过基因组DNA上的Sanger测序分析基因编辑。分析显示了具有纯合790 bp缺失的克隆线kicri002a-4，跨越了内含子5和外显子5和6的一部分（chr2：g.144,404,077 - 144,404,404,404,867del;1 a;补充。图1 A-B）。 外显子5和外显子6的其余部分被融合，预测氨基酸194上的截短的Zeb2 mRNA，其截短的Zeb2 mRNA（PTC）（P.THR188888888888888888888888;图1 A-B）。外显子5和外显子6的其余部分被融合，预测氨基酸194上的截短的Zeb2 mRNA，其截短的Zeb2 mRNA（PTC）（P.THR188888888888888888888888;图1 a）。与136PTC位于编码N末端锌指（NZF）域的区域以及更C末端的R-SMAD结合域（SBD），CTBP相互作用结构域（CID）（CID）和C-末端的c-terminal Zinc Zinc Finger（CZF（CZF）和Homeododomain（例如Domains）（epifa）（epifa）。
非洲 iPSC 倡议 Mahmoud B. Maina1
此预印本的版权所有者于 2025 年 1 月 27 日发布此版本。；https://doi.org/10.1101/2025.01.24.25320911 doi: medRxiv preprint