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mRNA产品开发和法规的平台技术方法
摘要：mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）药物可以视为平台技术，因为对于不同的疾病和条件，开发过程与不同的疾病和条件相似，具有相似的非编码mRNA序列和脂质纳米颗粒，并且基本上不变的制造和分析方法通常用于不同产品。至关重要的是，不要在开发，监管机构批准和推出SARS-COV-2及其变体期间使用平台方法构建的动量。本评论根据平台的质量，制造，临床前和临床数据提出了一组对mRNA产品的现有调节要求的修改。第一次，当mRNA序列和LNP组成在不同产品中也有所不同时，我们首次解决了开发和潜在的调节需求。此外，我们提出了考虑自我扩增mRNA，个性化肿瘤学mRNA产物和mRNA Therapeutics的考虑。为学术和商业团体提供可预测的开发途径，以便他们可以详细了解哪种产品特征和数据需要用于监管提交的档案具有许多潜在的好处。这些包括：降低发展和监管成本；面对大流行时，更快的消费者/患者访问以及产品的敏捷开发；对于罕见的疾病，癌症患者的替代疾病可能不存在或增加生存率和生活质量。因此，围绕平台方法达成共识既紧急又重要。这种用mRNA的方法可以成为其他治疗剂和疫苗类似平台框架的模板，以实现更有效的开发和调节审查。
Synplogen和Fujifilm Toyama Chemical Inter for MRNA Therapeutics CDMO服务的战略业务联盟协议，以提供从mRNA序列设计到LNP配方的无缝端到端服务
分析我们的研发中心的基因治疗的高质量，具有成本效益的病毒载体的技术转移
用于原位嵌合抗原受体单核细胞工程的氧化 mRNA 脂质纳米粒子
嵌合抗原受体 (CAR) 单核细胞和巨噬细胞疗法是有前途的实体瘤免疫疗法，可以克服传统 CAR T 细胞疗法面临的挑战。mRNA 脂质纳米颗粒 (mRNA-LNPs) 为原位改造具有瞬时和可调 CAR 表达的 CAR 单核细胞提供了可行的平台，以降低肿瘤外毒性并简化细胞制造。然而，使用传统的筛选技术很难识别具有单核细胞趋向性和细胞内递送能力的 LNPs。在这里，可电离脂质设计和高通量体内筛选被用于识别具有先天趋向性和向单核细胞递送 mRNA 的新型氧化 LNPs。合成氧化 (oLNPs) 和未氧化 LNPs (uLNPs) 库以评估向免疫细胞递送 mRNA。 oLNP 在形态、电离能和 p K a 方面表现出显著差异，从而增强了向人类巨噬细胞而非 T 细胞的递送。随后，使用 DNA 条形码进行体内文库筛选，确定了一种具有先天向性单核细胞的 oLNP 配方 C14-O2。在一项概念验证研究中，C14-O2 LNP 用于原位设计功能性 CD19-CAR 单核细胞，以治疗健康小鼠的严重 B 细胞发育不全 (45%)。这项工作突出了氧化 LNP 作为设计 CAR 巨噬细胞/单核细胞用于实体瘤 CAR 单核细胞治疗的有前途的平台的实用性。
纳米颗粒的组合设计用于肺mRNA递送和基因组编辑
使用病毒载体（例如AAV）实现了体内基因编辑，但是这些稳定的基于DNA的载体导致Cas9核糖核酸酶和SGRNA在细胞7中的长期表达。虽然扩展到编辑机械的接触可能有利于基因校正率，但它也可能导致脱靶遗传改变的积累8，9。此外，AAV CAPSIDS的免疫原性触发中和抗体和T细胞反应限制了基于AAV的治疗方法的重复给药10；但是，由于较高的细胞周转率11，肺中的基因编辑受益于重复给药。此外，尺寸限制对将有效的Pyogenes CRISPR-CAS9（SPCAS9）构建体构成了挑战，将其限制到AAVS 12中。可以通过非病毒，基于mRNA的递送平台来克服这些局限性，该平台能够瞬时表达并重复给药13。LNP是最先进的非病毒载体，如Moderna和Pfizer/Biontech开发的广泛接受的mRNA疫苗技术所见，并在Cas9肝基因编辑平台14-16中显示出巨大的希望。然而，尚未报告基于LNP的CAS9递送系统，用于有效的肺基因修饰。与肝脏相比，由于其专门的细胞类型，粘液屏障和粘膜缩减清除率，肺部对分娩构成了独特的挑战。因此，由于大多数病毒和非病毒方法17，气道上皮仍然很差，因此仍然需要采取有效的方法。
Dr. Roy van der MeelDr. Roy van der Meel
核酸疗法具有沉默，表达或编辑基因的巨大潜力。然而，基于核酸的药物需要化学修饰和复杂的纳米技术，以防止其降解，减少免疫刺激作用并确保细胞内递送。脂质纳米颗粒（LNP）技术是当前的黄金标准输送平台技术，它已使第一种siRNA药物Onpattro和COVID-19-19-MRNA疫苗的临床翻译能够进行临床翻译。尽管如此，目前批准的LNP系统主要适合静脉内治疗后地方给药或肝脏输送后的疫苗目的。在这里，我引入了一个基于天然脂蛋白的纳米传递平台，该平台防止了小型干扰RNA（siRNA）的过早降解，以确保其靶向和细胞内递送到造血茎和祖细胞和祖细胞（HSPC）中。建立了稳定地融入其核心的原型载脂蛋白脂质纳米颗粒（ANP）后，我们构建了一个全面的库，我们彻底地表征了单个ANP的物理化学特性。在对所有制剂进行体外筛选后，我们选择了八个代表图书馆多样性的siRNA-ANP，并确定了它们使用乱伦施用方案在小鼠中的免疫细胞亚群中沉默溶酶体相关的膜蛋白1（LAMP1）的能力。我们的数据表明，使用不同的ANP，我们可以在免疫细胞亚群及其骨髓祖细胞中实现功能基因沉默。除了基因沉默之外，ANP平台接合免疫细胞的固有能力为其提供了巨大的潜力，可以将其他类型的核酸疗法传递给HSPC。
用于超低剂量 CRISPR/Cas9 基因编辑的脂异肽复合物
评估了含有琥珀酰四乙烯五胺 (Stp) 和脂氨基脂肪酸 (LAF) 的双 pH 响应异种肽载体用于基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑。使用三种不同的基因组靶标（Pcsk9、eGFP、mdx 外显子 23），在三种不同的报告细胞系中筛选了不同的载体拓扑结构、LAF/Stp 比率的变化和 LAF 类型作为 Cas9 mRNA/sgRNA 多聚复合物。鉴定出一种 U 形和三种束 (B2) 形脂异种肽，它们表现出显著的效率。在亚纳摩尔 EC 50 浓度分别为 0.4 nM sgRNA 和 0.1 nM sgRNA 的顶级 U 形和顶级 B2 载体中，即使在全 (≥ 90%) 血清中孵育后，仍观察到顶级载体的基因组编辑效力。多聚复合物与单链 DNA 模板共同递送 Cas9 mRNA/sgRNA，用于同源性定向基因编辑，导致报告细胞中 eGFP 转化为 BFP 的比例高达 38%。顶部载体被配制成多聚复合物或脂质纳米颗粒 (LNP)，随后用于体内给药。制剂在 4 ◦ C 下储存时表现出长期的物理化学和功能稳定性。重要的是，静脉内注射多聚复合物或 LNP 介导肌营养不良蛋白基因的体内编辑，触发肌营养不良蛋白表达的心肌、骨骼肌和脑组织中 mRNA 外显子 23 剪接调节。
分支可电离脂质可增强 mRNA 的稳定性、融合性和功能性传递
蛋白质替代疗法、基因组工程和基因重编程。[4,5] 值得注意的是，mRNA 疫苗已获批准用于应对 COVID-19 大流行，并且有助于显著降低由此产生的死亡率。[6,7] 尽管 mRNA 在进一步的药物应用方面具有巨大潜力，但由于其分子量大、多阴离子性质和固有的化学不稳定性，其细胞内递送仍然是一个挑战。脂质纳米颗粒 (LNP) 是可用于有效体内递送外源 mRNA 的最先进技术之一。它们通常由可电离脂质、胆固醇 (chol)、辅助脂质和聚乙二醇 (PEG) 脂质组成，它们负责抑制 mRNA 降解和穿过质膜进入细胞溶胶的运输。可电离脂质是大多数 LNP 的关键成分，因为它们可以通过静电相互作用封装 mRNA。在生理 pH 下，中性电荷可改善体内的药代动力学，而在酸性 pH 下，质子化脂质可促进与内体膜融合并将 mRNA 释放到细胞溶胶中。典型的可电离脂质的头部和尾部基团具有不同的作用。头部基团是带正电的部分，通常具有叔胺，叔胺有多种类型，例如烷基和环状胺。[8] 头部基团决定了 LNPs 的表观 pKa，从而调节其在体内的命运。相反，脂质尾部是疏水部分，负责颗粒的形成。不饱和尾部、[9] 可生物降解尾部、[10,11] 聚合物尾部、[12,13] 和支链尾部 [14,15]
使用工程化的 CD4+ 细胞归巢 mRNA-LNP 实现高效的 CD4+ T 细胞靶向和基因重组
核苷修饰的信使 RNA (mRNA)-脂质纳米颗粒 (LNP) 是首批两种 EUA（紧急使用授权）COVID-19 疫苗的基础。核苷修饰的 mRNA 作为药理学药剂的使用为治疗、预防和诊断分子干预开辟了巨大的机会。特别是，基于 mRNA 的药物可以特异性地调节免疫细胞，例如 T 淋巴细胞，用于肿瘤、传染病和其他疾病的免疫治疗。然而，关键的挑战是 T 细胞对外源 mRNA 的转染具有众所周知的抵抗力。在这里，我们报告将 CD4 抗体结合到 LNP 上可以实现对 CD4+ 细胞（包括 T 细胞）的特定靶向和 mRNA 干预。全身注射给小鼠后，CD4 靶向放射性标记的 mRNA-LNPs 在脾脏中积聚，与非靶向 mRNA-LNPs 相比，从脾脏分离的 T 细胞中的报告 mRNA 信号高 30 倍。静脉注射载有 Cre 重组酶编码 mRNA 的 CD4 靶向 LNPs 可产生特定的剂量依赖性 loxP 介导的基因重组，导致脾脏和淋巴结中分别约 60% 和 40% 的 CD4+ T 细胞表达报告基因。T 细胞表型显示 T 细胞亚群的转染均匀，在幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应细胞中 CD4 靶向 mRNA-LNPs 的摄取没有差异。本研究建立的特异性和高效 mRNA 靶向和转染 T 细胞的方法为毁灭性疾病的免疫治疗和 HIV 治愈提供了平台技术。
脂质纳米颗粒有效地提供了基本编辑器ABE8E，以进行col7a1校正，以疾病性表皮溶液bullosa成纤维细胞Invitro
到编辑脂质纳米颗粒（LNP）已被广泛批准，并在全球范围内用于传递mRNA。lnps可以包装并传递mRNA编码的基因编辑器，包括腺嘌呤碱基编辑器，它们将T碱基对转换为无需双重DNA断裂或供体DNA的G C C碱基对（Gaudelli等，2017）。腺嘌呤基本编辑器是一种潜在的治疗方法，用于遗传性疾病营养不良的表皮溶液Bullosa（DEB）。deb是由COL7A1的致病变异引起的，导致功能障碍或不存在VII型胶原蛋白（C7），这是固定纤维的主要组成部分，它们粘附了皮肤E表皮连接，从而使皮肤稳定性（Bardhan等，2020）。目前无法治愈DEB；然而，W 90％的Col7a1变体是单核苷酸变体，c> t单核苷酸变体可用于W 60％的变体（Clinvar数据库； 2023年8月访问）。这些变体是由腺嘌呤碱基编辑器定位的；我们的小组和其他人已经证明了腺嘌呤基本编辑器在恢复病原变体和恢复C7表达方面的实用性（Osborn等，2020; Sheriff等，2022）。在这项研究中，我们首先探讨了新型LNP的使用，以mRNA格式传递ABE8E（Richter等，2020），其单一指定RNA（SGRNA）针对致病性C.5047 c> t col7aa1 col7a1 col7a1变体在患者锻造的纸张中
从液体活检中的位点特异性DNA甲基化作为药效学
Omega Therapeutics开发了一个可编程表观基因组mRNA药物的新型平台，能够修改染色质状态以在转录前的水平上特异性调节基因表达。OTX-2002是通过脂质纳米颗粒（LNP）传递的第一类mRNA治疗，是表观基因组控制剂（ECS）的临床发展。Mychelangelo I试验（NCT05497453）研究了肝细胞癌（HCC）患者对MYC对MYC的转录前抑制作用。OTX-2002编码两种蛋白质，这些蛋白质持久地通过MYC基因座的CpG DNA甲基化部分地修饰染色质。我们先前已经表明，EC定向的MYC甲基化会导致MYC表达的下调和HCC细胞活力在体外的损失和体内HCC异种移植生长的抑制。1