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开发用于从遥远个体获得基因检测的生物样品的方案
Omega Bio Tek E.Z.N.A. 组织DNA KIT D3396-01 OMEGA BIO TEK MAG-BIND®血液和组织DNA HDQ 96 KIT M6399-00 OMAMGA BIO TEK E.Z.N.A. Kit CMG-196 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit A1120 Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System A2360 Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit MB1004 Promega ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System A2051 Promega Wizard HMW DNA Extraction Kit A2920 Promega ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System A5081 Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit 69504 Qiagen QIAamp Fast DNA Tissue Kit 51404 Qiagen Puregene Tissue Kit 158063 Qiagen QIAGEN Genomic-tips 20/G 10223 Qiagen MagAttract HMW DNA Kit 67563 Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit 51104 Qiagen Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (25) 13323 Sigma-Aldrich Extract-N-AMP Tissue PCR Kit XNAT2-1KT Sigma-Aldrich GenElute Blood Genomic DNA Kit NA2010-1KT Takara NucleoSpin Tissue 740952.5 Takara NucleoMag Tissue 744300.1 Takara NucleoSpin® 96 DNA RapidLyse 740110.1 Takara NucleoBond HMW DNA 740160.2 Takara NucleoMag DNA Swab 744601.1 Takara NucleoSpin® Blood 740951.5 Takara NucleoMag® Blood 200 µL 744501.1 Thermo DNA Extract All Reagents Kit 4403319 Thermo MagMax DNA Multi-Sample Kit 4413020 Thermo JetFlex Genomic DNA Purification Kit A30700 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit CS11204 Zymo Quick-DNA MiniPrep D3024 Zymo Quick-DNA Miniprep Plus D4068 Zymo Quick-DNA magbead Plus Kit D4081 Zymo Quick-DNA HMW HMW Magbead d6060Omega Bio Tek E.Z.N.A.组织DNA KIT D3396-01 OMEGA BIO TEK MAG-BIND®血液和组织DNA HDQ 96 KIT M6399-00 OMAMGA BIO TEK E.Z.N.A. Kit CMG-196 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit A1120 Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System A2360 Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit MB1004 Promega ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System A2051 Promega Wizard HMW DNA Extraction Kit A2920 Promega ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System A5081 Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit 69504 Qiagen QIAamp Fast DNA Tissue Kit 51404 Qiagen Puregene Tissue Kit 158063 Qiagen QIAGEN Genomic-tips 20/G 10223 Qiagen MagAttract HMW DNA Kit 67563 Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit 51104 Qiagen Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (25) 13323 Sigma-Aldrich Extract-N-AMP Tissue PCR Kit XNAT2-1KT Sigma-Aldrich GenElute Blood Genomic DNA Kit NA2010-1KT Takara NucleoSpin Tissue 740952.5 Takara NucleoMag Tissue 744300.1 Takara NucleoSpin® 96 DNA RapidLyse 740110.1 Takara NucleoBond HMW DNA 740160.2 Takara NucleoMag DNA Swab 744601.1 Takara NucleoSpin® Blood 740951.5 Takara NucleoMag® Blood 200 µL 744501.1 Thermo DNA Extract All Reagents Kit 4403319 Thermo MagMax DNA Multi-Sample Kit 4413020 Thermo JetFlex Genomic DNA Purification Kit A30700 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit CS11204 Zymo Quick-DNA MiniPrep D3024 Zymo Quick-DNA Miniprep Plus D4068 Zymo Quick-DNA magbead Plus Kit D4081 Zymo Quick-DNA HMW HMW Magbead d6060
NextFlex®快速XP V2 DNA-Seq Kit
将每个细胞悬浮液添加到包含0.5 mM玻璃珠的2 mL管中（CAT＃19-622）。然后以3、4和5的速度在Omni珠子破裂4（CAT＃25-010）中均匀地均匀，持续45秒。加工后，将裂解物转移到清洁2毫升试管中，并以10,000 x g离心1分钟，以弥补任何细胞碎屑。使用Quick-DNA™真菌/细菌微型REIPREP试剂盒（Zymo，Cat＃D6005）1 µL DNA洗脱器在纳米光谱表（Thermo Fisher）上量化1 µL DNA洗脱器，以确定DNA浓度和纯度。
16S rRNA基因的基于不同鸟类粪便的微生物群在很大程度上独立于DNA保存和提取方法
鸟类肠道菌群一直是最近关注的主题，对诸如家禽行业，微生物生态学和保护等各种领域的潜在影响。粪便微生物群经常用作肠道菌群的非侵入性代理，但是从鸟类粪便中提取高质量的微生物DNA经常被证明具有挑战性。在这里，我们旨在评估两种DNA保存方法（95％乙醇和rnalater）和五种提取方法（Indispin病原体试剂盒，Qiaamp PowerFecal ProFecal Pro DNA Kit，Microgem Prepgem Prepgem细菌试剂盒，Zymbobiommics DNA Miniprep Kit和In Bane In In Base AVA AVA）用于研究。对这些方法对来自最初三种禽类（鸡，鸵鸟和无飞行parrotkākāpō）的粪便样品的功效的系统测试发现，提取的DNA的质量，数量和完整性在提取的DNA的质量，数量和完整性上存在实质性差异，但对16S rRNA Gene基于基于基于的RRNA Gene Microbobiota profiles的质量，数量和完整性却微不足道。随后在10种系统发育和生态上多样化的鸟类物种上选择了保存和提取方法的选定组合，重申了所选方法的疗效，细菌群落结构通过技术复制的特定禽类强烈聚集。我们发现，提取功效的明显差异似乎不会影响16S基因基因的细菌群体概况，为正在进行的对鸟类肠道微生物群的研究奠定了重要的基础。
血斑卡上动物粪便物质的 DNA 提取方案
159 图 2. 实验设置以确定适用于 DBS 的 DNA 提取和纯化方案 160。测试的不同方法是 DNA_P1) QIAsymphony® PowerFecal® Pro DNA 161 试剂盒（目录号 938036，Qiagen），包括在 FastPrep-24™ Classic 162 上以 6 m/s 的速度进行 6 轮均质化 162 60 秒，中间休息 5 分钟，然后用 163 蛋白酶 K 600 mAU/ml（Qiagen）消化，然后在 QIAsymphony® SP 164 机器人（Qiagen）上进行自动纯化。DNA_P2) 执行与 DNA_P1 相同，但不进行蛋白酶 K 处理。 DNA_P3) ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) 经 FastPrep-24™ Classic 匀浆化后，以 6m/s 的速度匀浆 60 秒，共 6 轮，中间间隔 5 分钟。DNA_P4) MagNA Pure 96 DNA 和 Viral NA 小容量试剂盒在 MagNA Pure 96 仪器 (Roche, Basel, Switzerland) 上进行，采用蛋白酶 K 预处理步骤和标准缓冲液，使用针对双链 DNA 和下一代测序优化的 DNA Blood ds SV 方案。其中，DNA_P1、DNA_P2、DNA_P3 和 DNA_P4 用于从模拟物、空白和猪粪便中提取 DNA，DNA_P1 在所有研究动物的粪便上进行性能测试，此外还对阳性和空白对照进行了三份重复测试。使用 DNA_P1 从牛、马、犬、羊和猪的粪便中提取 DNA，并在 Illumina NovaSeq 上进行测序，从每个样本中生成 >2000 万个 PE 读数。这些数据集用于告知所需的测序工作量。
分子生物学中的技术 - 质粒DNA的方法...
t eChniquers i n M Olecular b Iology - 用于P LASMID DNA I求解DNA分离的方法：分子生物学技术在复杂基因组分析中的应用取决于准备纯质粒DNA的能力。大多数质粒DNA隔离技术有两种口味，简单 - 低质量的DNA制剂，更复杂，耗时但高质量的DNA制剂。对于许多DNA操作，例如限制酶分析，亚克隆和琼脂糖凝胶电泳，简单的方法就足够了。大多数DNA测序，PCR操作，转换和其他技术都需要高质量的制剂。大多数方法都以大量细菌细胞开头，这些细菌细胞包含选择的质粒并离心至颗粒。然后，细胞在基本条件下通过洗涤剂钠硫酸盐（SDS）的混合物裂解，或添加蛋白酶（溶菌酶）以削弱和破坏宿主细胞壁。这两种方法的结果都导致紧凑型超螺旋质粒DNA分子释放到溶液中。下一个问题是将RNA，基因组DNA和其他细胞成分与细胞分开。如何完成此操作取决于所使用的方法。碱性裂解制剂是隔离少量质粒DNA的最常用方法，通常称为小型质子。此方法将SDS用作弱洗涤剂，以在NaOH存在的情况下使细胞变性，该清洁剂可将细胞壁和其他细胞分子水解起来。高pH值通过添加乙酸钾进行中和。这将质粒DNA和RNA留在溶液中。钾对样品有额外的影响。钾离子与SD相互作用，使其成为不溶性的洗涤剂。SD会很容易沉淀，并且可以通过离心分离。这样做的不溶性SDS会捕获较大的基因组DNA并将其从上清液中清除。通常通过添加RNASEA消化去除RNA。这仅留下溶液中的蛋白质，碳水化合物和RNA核苷单体。原发性醇（例如乙醇或丙醇）用于沉淀DNA。这是通过对水的重新排序来实现的，使DNA聚集体并变得不溶性。结果是一种纯净的DNA颗粒，可以重悬于温和缓冲的溶液或水中。建议使用大量培养物中煮沸的微型REIPREP来制备少量的质粒DNA。虽然此方法非常快，但产生的DNA质量低于碱性裂解小型培训的质量。在碱性裂解小型方法中，溶菌酶用于水解负责使细菌细胞壁具有其强度的广泛交联蛋白。然后将细胞煮沸以进一步使蛋白质结染并破坏细胞壁。然后用酒精沉淀质粒DNA。这两种方法都将仅产生几µg质粒DNA。对于纯度较高的较大数量，需要许多其他步骤。通过在非常高的重力力下在氯化丘密度梯度中离心，根据其密度分离其密度。氯化剖腹梯度产生的高质量质粒DNA不含大多数污染物，但使用溴化乙锭来识别DNA（潜在的诱变剂），并且需要长时间的超级离心运行以建立密度梯度。该方法是通过使用碱性裂解方法裂解细胞的，并在350,000 x g下离心14小时。首先，将CSCL梯度在小管中制成，并用溴化乙锭添加DNA。在旋转时，DNA将向下迁移，直到达到与质粒相同的CSCL的密度。因此，较大的DNA将与紧凑的质粒DNA分离。用紫外线可视化质粒带，用针切除，然后重复该过程。您可以看到，这是一种非常复杂且乏味的方法，用于隔离DNA，通常不经常在柱分离的出现中使用。现在存在一种更流行的方法，它利用了质粒DNA的物理特性和碱性裂解方法中发现的污染物的差异。核酸是负电荷的，因此可以使用阴离子交换
Transit®-CHO转染套件
转染时细胞密度（％汇合）。转染时CHO细胞亚型的建议细胞密度≥80％汇合。确定每个CHO细胞亚型的最佳细胞密度，以最大程度地提高转染效率。在转染前18-24小时将细胞划分，以确保细胞在转染时积极分裂并达到适当的细胞密度。DNA纯度。使用高度纯化，无菌和无污染物的DNA进行转染。无内毒素且具有260/280的吸光度比为1.8-2.0的质粒DNA准备。DNA，因为它可能包含高水平的内毒素。我们建议使用Miraclean®内毒素去除试剂盒（miR 5900）从DNA制备中去除内毒素的任何痕迹。TransIt® -cho试剂：DNA比。作为起点，使用3 µL每1 µg DNA的反式IT-CHO试剂。可以通过从每µg 1-5 µl的DNA滴定试剂来确定最佳的反式IT-CHO试剂与DNA比。请参阅第3页的表1，以获取建议的起始条件。CHOMOJO试剂：DNA比率。根据细胞培养和实验条件，可能需要不同的Cho Mojo试剂量。最佳的Cho Mojo试剂：DNA比应通过滴定从每µg每µg DNA滴定为0-2 µl的试剂来确定。请参阅第3页的表1，以获取建议的起始条件。复杂的形成条件。准备trans It-cho：Cho Mojo：无血清生长培养基中的DNA复合物。Mirus建议Opti-Mem I还原媒介。细胞培养条件：适当的培养基中，有或没有血清的培养细胞。无需执行介质更改即可去除转染络合物。反式转染试剂盒在没有转染后培养基变化的情况下进行转染时会提高效率。存在抗生素：抗生素将抑制转染复合物的形成，因此应排除在复合形成步骤中。可以将转染复合物添加到包含低水平抗生素（0.1-1倍终浓度的青霉素/链霉素混合物）的完整培养基中生长的细胞中。转染后的孵育时间。确定每种细胞类型后转染后最佳的孵育时间。最佳孵育时间通常为24-72小时，但会根据实验的目标，质粒的性质和表达蛋白质的半衰期而变化。