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t eChniquers i n M Olecular b Iology - 用于P LASMID DNA I求解DNA分离的方法：分子生物学技术在复杂基因组分析中的应用取决于准备纯质粒DNA的能力。大多数质粒DNA隔离技术有两种口味，简单 - 低质量的DNA制剂，更复杂，耗时但高质量的DNA制剂。对于许多DNA操作，例如限制酶分析，亚克隆和琼脂糖凝胶电泳，简单的方法就足够了。大多数DNA测序，PCR操作，转换和其他技术都需要高质量的制剂。大多数方法都以大量细菌细胞开头，这些细菌细胞包含选择的质粒并离心至颗粒。然后，细胞在基本条件下通过洗涤剂钠硫酸盐（SDS）的混合物裂解，或添加蛋白酶（溶菌酶）以削弱和破坏宿主细胞壁。这两种方法的结果都导致紧凑型超螺旋质粒DNA分子释放到溶液中。下一个问题是将RNA，基因组DNA和其他细胞成分与细胞分开。如何完成此操作取决于所使用的方法。碱性裂解制剂是隔离少量质粒DNA的最常用方法，通常称为小型质子。此方法将SDS用作弱洗涤剂，以在NaOH存在的情况下使细胞变性，该清洁剂可将细胞壁和其他细胞分子水解起来。高pH值通过添加乙酸钾进行中和。这将质粒DNA和RNA留在溶液中。钾对样品有额外的影响。钾离子与SD相互作用，使其成为不溶性的洗涤剂。SD会很容易沉淀，并且可以通过离心分离。这样做的不溶性SDS会捕获较大的基因组DNA并将其从上清液中清除。通常通过添加RNASEA消化去除RNA。这仅留下溶液中的蛋白质，碳水化合物和RNA核苷单体。原发性醇（例如乙醇或丙醇）用于沉淀DNA。这是通过对水的重新排序来实现的，使DNA聚集体并变得不溶性。结果是一种纯净的DNA颗粒，可以重悬于温和缓冲的溶液或水中。建议使用大量培养物中煮沸的微型REIPREP来制备少量的质粒DNA。虽然此方法非常快，但产生的DNA质量低于碱性裂解小型培训的质量。在碱性裂解小型方法中，溶菌酶用于水解负责使细菌细胞壁具有其强度的广泛交联蛋白。然后将细胞煮沸以进一步使蛋白质结染并破坏细胞壁。然后用酒精沉淀质粒DNA。这两种方法都将仅产生几µg质粒DNA。对于纯度较高的较大数量，需要许多其他步骤。通过在非常高的重力力下在氯化丘密度梯度中离心，根据其密度分离其密度。氯化剖腹梯度产生的高质量质粒DNA不含大多数污染物，但使用溴化乙锭来识别DNA（潜在的诱变剂），并且需要长时间的超级离心运行以建立密度梯度。该方法是通过使用碱性裂解方法裂解细胞的，并在350,000 x g下离心14小时。首先，将CSCL梯度在小管中制成，并用溴化乙锭添加DNA。在旋转时，DNA将向下迁移，直到达到与质粒相同的CSCL的密度。因此，较大的DNA将与紧凑的质粒DNA分离。用紫外线可视化质粒带，用针切除，然后重复该过程。您可以看到，这是一种非常复杂且乏味的方法，用于隔离DNA，通常不经常在柱分离的出现中使用。现在存在一种更流行的方法，它利用了质粒DNA的物理特性和碱性裂解方法中发现的污染物的差异。核酸是负电荷的，因此可以使用阴离子交换
分子生物学中的技术 - 质粒DNA的方法...
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