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使用牛津纳米孔测序的放大DNA异质性评估应用于细胞无细胞表达模板
摘要在这项工作中，将牛津纳米孔测序作为量化放大DNA异质性的可访问方法。此方法可以快速量化缺失，插入和取代，每个突变误差的概率及其在复制序列中的位置。放大技术测试的是传统的聚合酶链反应（PCR），具有不同水平的聚合酶保真度（OnETAQ，phusion和Q5），以及滚动圆扩增（RCA）和PHI29聚合酶。还评估了使用细菌扩增的质粒扩增。通过分析每个样本中大量序列中误差的分布，我们检查了每个样本中的异质性和误差模式。该分析表明，Q5和渗流聚合酶表现出在扩增的DNA中观察到的最低错误率。作为二级验证，我们分析了使用细胞游离表达与放大DNA合成的SFGFP荧光蛋白的发射光谱。易易受错误的聚合酶链反应证实了报道蛋白发射光谱峰宽度与DNA误差率的依赖性。所提出的纳米孔测序方法是量化其他基因扩增技术准确性的路线图，从而使它们被发现，从而实现了所需蛋白质的更无均匀的细胞表达。
用单个分子检测疾病：基于纳米孔的传感器可以改变诊断
CP和电荷存储模型。a，通过数值求解Poisson – Nernst – Planck和Navier -Stokes方程获得的纳米纤维内部离子的平均浓度和–200 mV。在模拟中使用的大量离子浓度为10 mM，离子特性为K +和Cl - 。孔的表面电荷为-10 mc M –2。b，CP因子是数值模拟预测的离子浓度的函数。c，d，传统电容器的示意图，其中电荷在空间中分开，并且在换压时可以放电。e，f，一个离子负电容器的示意图，其中电荷被共定位，但仍可以随电压变化而放电。Q与V曲线的负斜率是负电容的特征。信用：自然纳米技术（2025）。doi：10.1038/s41565-024-01829-5
dive novo纳米孔基因组测序临床Diutina catenulata型型cbs565
受污染的奶酪，但这种物种越来越多地据报道，该物种越来越多地显示出高丙核麦克风的奶酪，这是人类侵入性感染的原因[4-6]。在这里，我们提供了从头基因组组装和临床D. catenulata型CBS565的注释。D. catenulata型CBS565在1926年是从一个痴呆症患者的粪便中分离出来的，当时居住在波多黎各[1]。基因组DNA提取。使用连接测序试剂盒（SQK-LSK109; ONT，UK，UK）和本机条形码套件（EXP-NBD114; ONT）进行连接测序试剂盒（SQK-LSK109； ONT）进行纳米孔测序文库制备。根据制造商的协议，将两个库运行到奴才流中心（Flo-Min106; ont）上。使用Guppy v5.0.16对原始的纳米孔读数进行了基础？B9FCD7B5B（ONT）使用设置 - 浮雕flo-min106-Kit SQK-LSK109-Barcode_kits exp-nbd114-device cuda：0，由消除电源和条形码放在同一软件中。使用参数-nano- raw \ fastq [ - uot-dir \ directory \ div> flye v2.9（https：//github.com/ fenderglass/flye; [8]）进行 de Novo基因组组装。使用GenomeQC评估了组装的基因组质量[9]。总基因组大小为14,464,696 bp，n50为2,438,920 bp，在9个重叠群上分配（范围为3,918,888-888-370,337 bp;
开发计算图像处理方法，用于定量分析从HS-AFM（AFMNANOQ）获得的纳米孔结构
摘要。高速原子力显微镜（HS-AFM）可实现具有特殊空间（X-Y平面中1 nm的生物结构的纳米级成像； z方向〜0.1 nm）和时间分辨率（每帧〜20 ms）。hs-afm在二维（2d）的前进中编码三维（3D）信息，其中结构的横向尺寸（x，y）与图像中的空间姿势相对应，而高度（z）信息则嵌入到像素强度中。这种独特的数据结构在分割和形态分析中提出了重大挑战，需要专门的计算方法。为了克服这些局限性，我们开发了“ AFMNANOQ”，这是一个由特征驱动的组合框架，用于分割HS-AFM数据的分割和形态测量。我们的方法独立于标记的培训数据，使数据稀缺性可靠，同时又是为未来深入学习应用程序提供高质量标记的数据集的强大工具。我们使用合成和实验性AFM/HS-AFM DATASET来验证AFMNANOQ，包括对α-蛋白素（αHl）的构象和动力学的半自动分析，一种β-桶孔形成孔（PFT），由葡萄球菌分泌的expaph-ylococcus a ylococcus a a paph-ylococcus a nurus。我们的方法通过深度学习模型实现竞争性能，同时保持各种HS-AFM数据集的卓越适应性。作为未来的观点，我们计划将其进一步开发或将其与深度学习模型相结合，以增强分割性能并从实验性AFM图像中重建3D结构。这将利用本研究中产生的构象文库，从而实现两种甲基化合物之间的交叉验证，并最终在AFM图像分析中弥合特征驱动和数据驱动的AP之间的差距。
DNA在牛津纳米孔上的条形码：多路复用多达24 x 96孔板
本协议描述了用于测序标准COI标记的实验室协议（即DNA条形码），多路复用多达2,280个标本（24 x 96井板，每个板的一个阴性对照孔），以在牛津纳米孔技术上运行，in 10.4.1在占用量序列仪上流动细胞。所有索引都是通过PCR使用标记的引物来完成的，这意味着图书馆准备仅在单个管中进行，所有2,280个PCR均得到了合并。这是通过不对称索引来完成的，其中带有96个唯一分子标识符（UMIS）的正向引物提供了映射到96孔板的孔，而带有24 UMIS的反向引物则将其映射到板上。
使用牛津纳米孔技术（ONT）
。cc-by 4.0国际许可（未经Peer Review尚未获得认证）是作者/资助者，他已授予Biorxiv的许可证，以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人，该版本发布于2025年1月12日。 https://doi.org/10.1101/2025.01.10.632410 doi：Biorxiv Preprint
balrog-mon：用于基因组牛津纳米孔
宏基因组测序是一种最近可行的方法，可以同时表征样品中的ARG，微生物组和病原体的数据，与分离和培养细菌相比，它是一种更有效，更全面的方法。对宏基因组数据的典型分析涉及一种基于组装的方法或基于读取的方法，每种方法都有其自身的好处和限制。宏基因组装配允许对ARGS进行上游或下游研究，并提供对其起源的准确识别。但是，这种方法可能导致信息丢失，因为低覆盖的基因组通常不会组装。相比之下，基于读取的方法可实现所有可用数据的映射，但缺乏探索周围基因组环境或提供准确分类分类的能力。为了应对这些挑战，我们开发了Balrog-mon，这是一种多功能且可重现的NextFlow管道，用于测量病原体和元基因组长阅读测序的ARG，提供“组装”和“无装配”工作流程选项。
使用瓷砖扩增子（Heptile）和基于探针的富集在Illumina和Nanobore平台上的整个基因组测序
乙型肝炎病毒（HBV）全基因组测序（WGS）目前受到限制，因为许多临床样品的DNA病毒载荷（VL）低于使用当前测序方法产生完整基因组所需的阈值。我们使用基于探针的捕获和瓷砖放大器PCR（Hep-tile）开发了两种泛基因型病毒富集方法，用于HBV WGS。我们使用模拟样品证明了这两种富集方法都是泛基因型（基因型A-J）。使用临床样品，我们证明了HEP-TILE放大成功地放大了最低的HBV VL测试（30 IU/ mL）的完整基因组，并且可以使用纳米孔和Illumina平台对PCR产物进行测序。基于探针的捕获，具有Illumina测序需要VL> 300,000 IU/mL，以生成全长HBV基因组。捕获 - 紫罗兰和Hep-tile-nanopore管道在具有已知DNA序列的模拟样品中具有100％的共识测序精度。一起，这些方案将促进HBV序列数据的产生，从而使HBV分子流行病学的更准确，更具有代表性的描述，对持久性和发病机理进行启示，并增强对感染及其治疗结果的理解。
通过病毒，细胞外囊泡和纳米颗粒的纳米孔进行光学定量
图1：A。本研究中使用的颗粒和实验方案的特征。从上到下：VLP HIV，像人免疫缺陷病毒的粒子一样； MLV，鼠白血病病毒； HBV，肝素B病毒； AAV，Adeno相关病毒（血清型8和9）；电动汽车，细胞外囊泡。需要荧光标记颗粒：可以通过基因组修饰（HIV和MLV的GFP标记）或直接通过在样品中添加荧光团（AAV和HBV的Yoyo-1，EVS的DIO）来实现。潜在的细胞DNA在VLP HIV和EV中以红色表示，MLV中的粉红色病毒RNA和HBV和AAV中的紫色病毒DNA表示。然后将样品稀释。大小由NTA确定HIV，MLV和EVS，以及AAV 37和HBV 38的冷冻EM重建。B.零模式波导设置，用于通过纳米孔转移的颗粒。顺式腔室包含荧光标记的颗粒。在施加压力时，颗粒在跨室中的孔中推动，并在孔末端越过evanevencent的田地区域时照亮。一旦他们离开了毛孔，他们就没有专心和漂白。C.事件的荧光演变是时间和粒子出口快照的函数。归一化强度表示为AAV时间的函数（紫罗兰和红点，平均在n = 50事件上）。通过最大强度分配强度获得归一化强度。时间在事件开始时被重新缩放至零，红点与事件发生前的强度相对应。指数衰减以蓝色表示。孔径400 nm，施加压力为0.5 mbar。帧速率：112 fps。插图：图像尺寸= 10 µm。
GREPore-seq：通过长距离 PCR 和纳米孔测序检测基因编辑后变化的强大工作流程
为了充分发挥基因编辑技术在临床治疗中的巨大潜力，需要彻底评估靶向编辑和非预期编辑的后果。然而，目前缺乏一种全面、流水线化、大规模且经济的工作流程来检测基因组编辑结果，特别是插入或删除大片段。在这里，我们描述了一种通过对条形码长距离 PCR 产物进行纳米孔池测序来有效准确地检测 CRISPR-Cas9 编辑后的多个基因变化的方法。为了克服纳米孔测序的高错误率和插入缺失，我们开发了一种流程，通过对纳米孔扩增子测序 (GREPore-seq) 的读取进行 grepping 来捕获条形码序列。GREPore-seq 可以检测 NHEJ 介导的双链寡脱氧核苷酸 (dsODN) 插入，其准确度与 Illumina 下一代测序 (NGS) 相当。GREPore-seq 还可以识别 HDR 介导的大基因敲入，这与 FACS 分析数据高度相关。还检测到了 HDR 编辑后的低水平质粒骨架插入。我们建立了一个实用的工作流程来识别遗传变化，包括量化 dsODN 插入、敲入、质粒骨架插入和 CRISPR 编辑后的大片段缺失。该工具包用于对汇集的长扩增子进行纳米孔测序，在评估靶向 HDR 编辑和超过 1 kb 的意外大插入缺失方面应具有广泛的应用。GREPore-seq 可在 GitHub 上免费获取（https://github.com/lisiang/GREPore-seq）。