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使用范德华异质结二极管检测和控制通过纳米孔的 DNA 转运
固态纳米孔传感的一个长期未实现的目标是在转位过程中实现 DNA 的平面外电传感和控制，这是实现碱基逐个棘轮的先决条件，从而实现生物纳米孔中的 DNA 测序。二维 (2D) 异质结构能够以原子层精度构建平面外电子器件，是用作电传感膜的理想但尚未探索的候选材料。在这里，我们展示了一种纳米孔架构，使用由 n 型 MoS 2 上的 p 型 WSe 2 组成的垂直 2D 异质结二极管。该二极管表现出由离子势调制的整流层间隧穿电流，而异质结势则相互整流通过纳米孔的离子传输。我们同时使用离子和二极管电流实现了 DNA 转位的检测，并展示了 2.3 倍的静电减慢的转位速度。封装层可实现稳健的操作，同时保留用于传感的原子级锐利 2D 异质界面的空间分辨率。这些结果为单个生物分子的非平面电传感和控制建立了范例。
使用纳米孔直接 RNA 测序对基因治疗载体进行质量控制的优化方案
尽管最近在提高慢病毒基因疗法的疗效方面取得了进展，但相当一部分生产的载体含有不完整且可能无功能的 RNA 基因组。这可能会破坏慢病毒的基因传递，并增加制造成本，必须加以改进以促进慢病毒基因疗法的广泛临床实施。在这里，我们比较了三种长读测序技术检测载体设计问题的能力，并确定纳米孔直接 RNA 测序是最强大的。我们展示了这种方法如何识别和量化由隐蔽剪接和多聚腺苷酸化位点引起的不完整 RNA，包括广泛使用的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE) 中的潜在隐蔽多聚腺苷酸化位点。使用慢病毒 RNA 的人工多聚腺苷酸化，我们还在分析的慢病毒载体中识别出多个发夹相关截断，这些截断占检测到的 RNA 片段的大部分。最后，我们表明这些见解可用于优化慢病毒载体设计。总之，纳米孔直接 RNA 测序是慢病毒载体质量控制和优化的有力工具，可能有助于改进慢病毒制造，从而开发更高质量的慢病毒基因疗法。
使用牛津纳米孔测序的放大DNA异质性评估应用于细胞无细胞表达模板
摘要在这项工作中，将牛津纳米孔测序作为量化放大DNA异质性的可访问方法。此方法可以快速量化缺失，插入和取代，每个突变误差的概率及其在复制序列中的位置。放大技术测试的是传统的聚合酶链反应（PCR），具有不同水平的聚合酶保真度（OnETAQ，phusion和Q5），以及滚动圆扩增（RCA）和PHI29聚合酶。还评估了使用细菌扩增的质粒扩增。通过分析每个样本中大量序列中误差的分布，我们检查了每个样本中的异质性和误差模式。该分析表明，Q5和渗流聚合酶表现出在扩增的DNA中观察到的最低错误率。作为二级验证，我们分析了使用细胞游离表达与放大DNA合成的SFGFP荧光蛋白的发射光谱。易易受错误的聚合酶链反应证实了报道蛋白发射光谱峰宽度与DNA误差率的依赖性。所提出的纳米孔测序方法是量化其他基因扩增技术准确性的路线图，从而使它们被发现，从而实现了所需蛋白质的更无均匀的细胞表达。
纳米孔自适应采样直接从血液样本中的疟原虫寄生虫的选择性全基因组测序
疟原虫的抽象全基因组测序正在成为疟疾基因组监测的越来越重要的工具。由于人类DNA在患者血液样本中占主导地位，因此需要耗时的实验室程序才能耗尽人DNA或富集疟原虫DNA。在这里，我们研究了纳米孔自适应采样的潜力，以富集恶性疟原虫读取，同时对未富裕的患者血液样本进行了测序。比较奴才设备上的自适应采样与常规测序，该稀释系列由0％–84％p进行稀释系列。对人DNA中的恶性DNA进行了测序。一半的流细胞通道以辅助采样模式运行，富集了恶性疟原虫参考基因组，从而在包含0.1％–8.4％的恶性疟原虫DNA的样品中富集了三到五倍的恶性疟原虫碱基。通过对具有常见寄生虫血症的三个恶性疟原虫患者血液样本进行测序，即在自适应模式下，为0.1％，0.2％和0.6％证实了这一发现。他们的估计富集分别为5.8、3.9和2.7，足以在中位数为5（最低寄生虫）或355（最高寄生虫）的中间深度（最低寄生虫）的中间深度（最低寄生虫）中覆盖至少97％的恶性疟原虫参考基因组。总共将38个耐药性基因座与Sanger测序结果进行了比较，表现出很高的一致性，这表明所获得的测序数据具有足够的质量，可以解决0.1％及更高寄生虫的患者的常见临床研究问题。总体而言，我们的结果表明，自适应纳米孔测序有可能在将来替代更多耗时的疟原虫富集方案。
解码靶向整合的复杂性：使用纳米孔测序表征 CRISPR-Cas9 靶位点的 DNA 插入
考虑到纳米孔测序的~5%测序错误（主要是插入和缺失）和供体片段的部分截断整合，我们在分配数据时基于预期的完美插入大小将间隔扩大±20%。然后，我们用正向骨架插入（Bf）、反向骨架插入（Br）、正向F8盒式插入（F8f）和反向F8盒式插入（F8r）的grepseqs分析了9个数据集特定长度范围内的数据。最后，我们计算出F8盒式插入和骨架整合的比例，分别为40.24%和44.47%。有趣的是，完全供体整合占总插入事件的14.16%，而其余的插入涉及两个相同的片段和三个片段的整合（图5B）。
使用靶向等温扩增和纳米孔测序的结核分枝杆菌快速耐药基因分型工作流程
摘要 结核病 (TB) 的表型药物敏感性测试 (DST) 需要数周才能产生结果。虽然分子测试可以快速检测出耐药相关突变 (DRM)，但它们无法扩展到覆盖整个基因组和可以预测耐药性的许多 DRM。全基因组测序 (WGS) 方法是可扩展的，但如果直接在痰液上进行，通常需要目标富集步骤，例如核酸扩增。我们开发了一种靶向等温扩增-纳米孔测序工作流程，用于快速预测结核病分离株的耐药性。我们使用重组酶聚合酶扩增 (RPA) 对结核分枝杆菌基因组内的三个区域进行靶向等温扩增（37°C，90 分钟），然后在 MinION 上进行纳米孔测序。我们检测了 29 种耐药性 (DR) 结核病患者的分枝杆菌基因组 DNA 提取物，并将我们的结果与 Illumina 的 WGS 和表型 DST 的结果进行比较，以评估对利福平和异烟肼耐药性的预测准确性。RPA 扩增的保真度与高保真度 PCR 相当（100% 一致）。纳米孔测序产生的 DRM 预测与 WGS 相同，测序运行时间明显更快，只需几分钟而不是几天。我们工作流程对利福平耐药性预测的灵敏度和特异性分别为 96.3%（95% 置信区间 [CI]，81.0 至 99.9%）和 100.0%（95% CI，15.8 至 100.0%）。对于异烟肼耐药性预测，敏感性和特异性分别为 100.0%（95% CI，86.3 至 100.0%）和 100.0%（95% CI，39.8 至 100.0%）。每个样本的工作流程耗材成本不到 100 英镑。我们快速且低成本的药物耐药性基因分型工作流程可准确预测利福平和异烟肼耐药性，适合在资源有限的环境中使用。
GREPore-seq：通过长距离 PCR 和纳米孔测序检测基因编辑后变化的强大工作流程
为了充分发挥基因编辑技术在临床治疗中的巨大潜力，需要彻底评估靶向编辑和非预期编辑的后果。然而，目前缺乏一种全面、流水线化、大规模且经济的工作流程来检测基因组编辑结果，特别是插入或删除大片段。在这里，我们描述了一种通过对条形码长距离 PCR 产物进行纳米孔池测序来有效准确地检测 CRISPR-Cas9 编辑后的多个基因变化的方法。为了克服纳米孔测序的高错误率和插入缺失，我们开发了一种流程，通过对纳米孔扩增子测序 (GREPore-seq) 的读取进行 grepping 来捕获条形码序列。GREPore-seq 可以检测 NHEJ 介导的双链寡脱氧核苷酸 (dsODN) 插入，其准确度与 Illumina 下一代测序 (NGS) 相当。GREPore-seq 还可以识别 HDR 介导的大基因敲入，这与 FACS 分析数据高度相关。还检测到了 HDR 编辑后的低水平质粒骨架插入。我们建立了一个实用的工作流程来识别遗传变化，包括量化 dsODN 插入、敲入、质粒骨架插入和 CRISPR 编辑后的大片段缺失。该工具包用于对汇集的长扩增子进行纳米孔测序，在评估靶向 HDR 编辑和超过 1 kb 的意外大插入缺失方面应具有广泛的应用。GREPore-seq 可在 GitHub 上免费获取（https://github.com/lisiang/GREPore-seq）。
靶向纳米孔测序技术检测支气管肺泡灌洗液标本中结核分枝杆菌的初步评估
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（M.tb）引起的传染病，对人类健康构成重大威胁。根据世界卫生组织（WHO）2021年全球结核病年度报告，中国估计有结核病病例约78万，估计结核病发病率约为每10万人55例，在30个结核病高负担国家中，中国估计结核病发病率位居第三位，低于印度尼西亚和印度。中国结核病病原体阳性率仅为58%（World Health O，2022）。因此，快速、准确的临床诊断方法对提高结核病诊断水平、治疗结核病患者、防止结核病传播至关重要。目前，在结核分枝杆菌（M.tb）的通用检测临床诊断方法中，AFB涂片具有检测方法快捷、简便、费用低廉的优势，但病原体阳性率低，M.tb.结核分枝杆菌培养时间长，无法满足临床快速诊断的要求。基于结核分枝杆菌培养的表型药敏试验（DST）受到生物安全、培养时间长及使用抗结核药物后培养率下降的影响。结核分枝杆菌生长缓慢的特点使得该方法耗时长、且由于培养不良或微生物污染等原因导致结果不确定，不能满足临床快速诊断的要求。快速准确地检测结核分枝杆菌样本和快速诊断耐药结核病是有效控制耐药结核病流行的关键。结核分枝杆菌的耐药表型主要通过多个基因的染色体突变来确认（Gygli et al.，2017）。例如，编码RNA聚合酶b亚基的rpoB基因突变导致的利福平耐药是结核分枝杆菌中最常见的基因突变。Xpert MTB/RIF检测采用半嵌套PCR直接从痰中检测结核分枝杆菌和rpoB基因突变。Xpert MTB/RIF最初于2010年被WHO推荐用于结核病诊断，但对于细菌载量较低的样本，Xpert MTB/RIF的检测结果灵敏度较低。此外，该检测只能检测利福平耐药突变，而不能报告突变类型。随着近年来新一代测序（NGS）的快速发展，WHO推荐使用NGS检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）的耐药相关突变，并有针对性地采用高通量测序
开发计算图像处理方法，用于定量分析从HS-AFM（AFMNANOQ）获得的纳米孔结构
摘要。高速原子力显微镜（HS-AFM）可实现具有特殊空间（X-Y平面中1 nm的生物结构的纳米级成像； z方向〜0.1 nm）和时间分辨率（每帧〜20 ms）。hs-afm在二维（2d）的前进中编码三维（3D）信息，其中结构的横向尺寸（x，y）与图像中的空间姿势相对应，而高度（z）信息则嵌入到像素强度中。这种独特的数据结构在分割和形态分析中提出了重大挑战，需要专门的计算方法。为了克服这些局限性，我们开发了“ AFMNANOQ”，这是一个由特征驱动的组合框架，用于分割HS-AFM数据的分割和形态测量。我们的方法独立于标记的培训数据，使数据稀缺性可靠，同时又是为未来深入学习应用程序提供高质量标记的数据集的强大工具。我们使用合成和实验性AFM/HS-AFM DATASET来验证AFMNANOQ，包括对α-蛋白素（αHl）的构象和动力学的半自动分析，一种β-桶孔形成孔（PFT），由葡萄球菌分泌的expaph-ylococcus a ylococcus a a paph-ylococcus a nurus。我们的方法通过深度学习模型实现竞争性能，同时保持各种HS-AFM数据集的卓越适应性。作为未来的观点，我们计划将其进一步开发或将其与深度学习模型相结合，以增强分割性能并从实验性AFM图像中重建3D结构。这将利用本研究中产生的构象文库，从而实现两种甲基化合物之间的交叉验证，并最终在AFM图像分析中弥合特征驱动和数据驱动的AP之间的差距。
使用牛津纳米孔扩增子测序的温室灌溉水中真菌和卵菌病原体的早期评估
水传播植物的致病真菌和卵菌是温室生产系统中的主要威胁。对这些病原体的早期检测和量化将使我们能够及时治疗所需的经济和生物阈值，从而改善有效的疾病管理。在这里，我们使用了牛津纳米孢子的扩增子来分析从用于生长番茄，黄瓜和Aeschynanthus sp的温室收集的灌溉水中的微生物群落。真菌和卵形群落的特征是使用放大整体内部转录垫片（ITS）区域的引物。为了评估小兵测序的灵敏度，我们将串行稀释的模拟DNA刺激到图书馆制备之前从温室水样品中分离的DNA中。真菌和卵骨读数的相对丰盛在温室灌溉水中和来自番茄番茄的设置中的水样中与众不同。在相应的连续稀释样品中衍生出的源自真菌和卵形模拟群落的序列读数是成比例的，因此确认了最小值扩增子测序对环境监测的适用性。通过使用尖峰标准来测试使用小兵测试定量的可靠性，我们发现样品中尖峰ins的检测受到了真菌或卵形DNA的背景量的高度影响。我们观察到，与较长的尖峰（> 790bp）相比，我们大多数稀释液的长度较短（538bp）的尖峰在我们的大部分稀释液中产生。此外，相对于稀释序列，序列读数不均匀，并且在具有最高DNA浓度的背景样品中最不可检索，这表明性能的动态范围狭窄。我们建议对小兵测序进行连续的基准测试，以改善未来快速植物性诊断和监测的定量元编码工作。