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AAV-RPGR 基因疗法挽救人类视网膜类器官模型中 RPGR 相关 X 连锁视网膜色素变性的视蛋白错误定位
摘要：视网膜色素变性 GTPase 调节剂 (RPGR) 基因内的变异是 X 连锁视网膜色素变性 (XLRP) 的主要原因，XLRP 是一种常见且严重的遗传性视网膜疾病。XLRP 的特征是光感受器的逐渐退化和丧失，导致视力丧失，并最终导致双侧失明。不幸的是，目前尚无针对 RPGR 相关 XLRP 的有效批准治疗方法。我们试图使用临床相关构建体研究 RPGR ORF15 基因补充在人类 RPGR 缺陷型视网膜类器官 (RO) 中的有效性。使用针对 RPGR 的成熟 CRISPR/Cas9 基因编辑方法生成同源 RPGR 敲除 (KO) 诱导的多能干细胞 (IPSC)。RPGR-KO 和同源野生型 IPSC 分化为 RO，并用于测试腺相关病毒 (AAV) RPGR (AAV-RPGR) 临床载体构建体。使用 AAV-RPGR 转导 RPGR-KO RO 成功恢复了 RPGR mRNA 和蛋白质的表达，并定位到杆状和锥状感光细胞中的感光连接纤毛。载体衍生的 RPGR 显示出与 WT RO 相同的谷氨酰化水平。此外，用 AAV-RPGR 治疗可恢复 RPGR-KO RO 内的视紫红质定位，从而减少对感光外核层的错误定位。这些数据提供了对 RPGR ORF15 基因补充在人类感光细胞中的功能效力的机制见解，并支持了之前报道的在 RPGR 相关 XLRP 患者中使用该载体构建体进行的 I/II 期试验的积极结果，该载体构建体目前正在进行 III 期临床试验。
使用FRET -COHEN LAB
微生物动蛋白衍生的遗传编码电压指标（GEVIS）是绘制细胞培养和活体动物生化动力学的强大工具。förster共振能量转移（FRET） - 粘胶GEVIS使用电压依赖于附着的荧光团的淬灭，达到高亮度，速度和电压敏感性。然而，据报道，在两光子（2p）激发下，大多数fret-opsin gevis的电压灵敏度降低或消失。在这里，我们研究了fret-opsin gevis voltron1和voltron2的光体物理学。我们发现，这两种GEVI的先前报道的负电压敏感性来自光循环间介导，而不是来自Opsin基态。两个GEVI的电压敏感性都是IL弹性强度的非线性功能；对于Voltron1，灵敏度在低强度照明下扭转了符号。使用光循环优化的2P照明方案，我们在活小鼠的桶形皮层中使用voltron2进行了2p电压成像。这些结果为体内的fret-oppin gevis optive of速2P电压成像打开了大门。
具有改进的耦合效率的工程Luminopsins
在行为实验动物中对神经元活性的操纵对于阐明脑功能的神经元网络至关重要。光遗传学1和化学遗传学2方法对于确定遗传定义的神经元种群对电路和行为输出的贡献仍然非常有价值。两种方法都具有明显的优势，并在精确的时间尺度上对神经元亚群的活性进行了光遗传控制，并且对整个神经元群体活性的化学遗传控制较慢。以前的工作已经开发了一种工具集，该工具集通过将光发射荧光素酶融合到光遗传学的光响应元件中，从而积分光学和化学遗传学方法，从而产生发光的Opsin或Luminopsin（LMO）（LMO）3 - 5 [图。1（a）]。通过荧光素酶氧化可扩散的荧光素底物产生的生物发光会激活附近的蛋白蛋白。取决于OPSIN的生物物质特性，荧光素酶产生的光可以激发或抑制表达LMO的靶神经元。将光学和化学方法的这种整合允许在同一实验动物中同一神经元的一系列空间和时间尺度上操纵神经活动。例如，可以将整个神经元群体激活的行为成分的贡献与同一神经元子集的群体进行比较，从而通过生物发光或光遗传纤维通过光纤维在化学上激活OPSIN化学。6
FT-002的试点基因治疗研究的初步安全性和功效引起的RPGR基因突变相关的X连锁性视网膜炎
疾病背景：X连锁性视网膜炎色素（XLRP）是一种严重的RP形式，其特征是夜失明，视力降低，外围视野的进行性恶化，并在40多岁后最终成为法律上的盲人。色素炎的变体GTPase调节剂（RPGR）基因占XLRP的70％以上，所有RPS的病例约为15％。RPGR ORF15的突变会导致RPGR ORF15蛋白质的截断以及其功能的损害或损失，从而导致OPSIN对光感受器内部节段或内质网的错误定位，这反过来会导致光感受器细胞的失败至关重要。RPGR-XLRP患者的患病率估计为男性为3.4-4.4/100,000，在美国和欧洲估计有20,000名患者，在中国有50,000名患者。
计算外在主义
6 有可能突变先出现，在这种情况下，旧大陆灵长类动物的三视蛋白嵌合体会像我下面讨论的新大陆猴一样发展，但后来又发生了一次基因复制，将两个视蛋白基因放在了同一个 X 染色体上。 7 一个随机过程还决定了细胞中表达给定 X 染色体的哪个视蛋白基因（Jacobs 2008；Neitz and Neitz 2011）。 8 吼猴是唯一已知的例外。它似乎独立经历了与旧大陆灵长类动物类似的过程（Jacobs 2002、2009）。 9 雄性拥有哪种等位基因似乎不会对色觉计算产生影响，尽管这确实会影响它们的一些辨别能力（Neitz and Neitz 2011，第 639 页）。 10 我将把“色彩视觉的新维度”这个短语视为“三色视觉”的替代品。一些作者不愿意将这两者等同起来，包括杰拉尔德·雅各布斯（个人通信），他进行了我下面讨论的一项实验。他指出，在他的小鼠实验中，色彩视觉的新维度局限于波长谱的一部分，而小鼠可能实际上是单色的。但是，新的视锥细胞类型仍然增加了波长谱那部分色彩视觉的维度，而不会改变所涉及的后马赛克电路；这种情况与全面的二色视觉转变为全面的三色视觉的情况没有太大区别，这就是我将要讨论的情况。
心律失常的非手术解决方案
视蛋白技术的新颖性可能成为社会逆境的潜在原因 尽管在技术、财务和社会方面存在某些限制，但我们的设备带来的好处仍然大于缺点。该设备的非侵入性使其能够解决 NHS 目前最紧迫的问题：资源匮乏。虽然这项技术仍需要大量研究，但一旦完全开发出来，它有可能解决传统起搏器中发现的各种医疗、技术和经济问题。 没有感染风险，因此提高了患者的安全性 由于该过程是非手术性的，因此对 NHS 的人力、资源和时间的需求较少 易于修复，因为对设备的任何损坏都是外部的，不像传统起搏器的导线断裂 内置的持续监控将信息发送到 NHS 数据库，从而可以更好地与临床医生建立联系
TMT-视蛋白以依赖于环境的方式差异调节青鳉的大脑功能
脊椎动物的行为受光的强烈影响。由功能性视蛋白编码的光受体存在于脊椎动物的大脑和外周组织中。这种表达特征从鱼类到人类都存在，并且在昼行性脊椎动物中尤为突出。尽管视蛋白的广泛存在，但它们的非视觉功能在很大程度上仍然是个谜。考虑到视蛋白的数量之多，这一点就更加明显了。硬骨鱼类拥有大约 40 个视蛋白基因，从幼年发育阶段到成年期都存在。许多视蛋白已被证明具有光受体的功能。这就提出了一个问题：这么大的数量是否主要反映了功能冗余，或者更确切地说，最大限度地使硬骨鱼类能够最佳地利用水下存在的复杂光信息。我们重点研究了 tmt-opsin1b 和 tmt-opsin2，它们是具有祖先类型序列特征的 c-视蛋白，在几种脊椎动物门中都得到保守，在非视杆、非视锥、非视网膜神经节细胞的脑组织中表达部分相似，光谱灵敏度也相似。对单突变体的特征描述揭示了年龄和光依赖性行为变化，以及对前激素 sst1b 和电压门控钠通道亚基 scn12aa 水平的影响。在 tmt- opsin1b 突变体中，白天休息量受到的影响与眼睛、松果体和昼夜节律时钟无关。我们进一步研究了 tmt-opsin1b/2 双突变体的白天行为和分子变化，发现尽管它们具有相似的表达和光谱特征，但这些视蛋白在某种程度上以非加性方式相互作用。具体而言，双突变体以部分年龄依赖的方式补充单突变体中观察到的分子和行为表型。我们的工作为解开高度复杂的
障碍与基因交换的耦合
光遗传学通过阐明表达Opsin的神经元的光线来彻底改变神经科学研究，以彻底改变其特定神经元的精确激活。由于光子的散射和吸收而导致神经组织中可见光的渗透深度有限，因此体内光遗传学的长期挑战。为了应对这一挑战，已经开发出Sono- optegenetics通过利用超声波和循环散发循环发光的机械发光的纳米转带的深层组织渗透能力和聚焦能力来实现三维神经组织中的时空精确光生产。在这里，我们对从超声和机械发光的物理原理到其新兴的神经科学研究的应用，对Sono optegenetics方法进行了全面综述。我们还讨论了一些有前途的方向，其中Sono-Optegenetics可以从机械发光材料的角度，超声 - 组织的相互作用，对“扫描Optogenotogenics”的独特神经科学机会产生持久的变革性影响。