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PE2 行动：政府运营气候行动计划
气候行动计划 (CAP) 是一种战略文件，它设定目标并概述一系列减少温室气体 (GHG) 排放的举措。CAP 以温室气体排放清单为基础，确定温室气体减排目标并提供实现这些目标的框架。CAP 确定优先行动并促进政府部门之间的协调。此外，CAP 通过建立评估进展的方法并在温室气体目标超额或未实现时调整当地战略，支持长期有效行动。通过为自己的运营制定这样的计划，地方政府发挥领导作用，并为社区提供有助于激励社区采取行动的范例。
具有PAM灵活性的工程精选编辑
为了将PE2变体的活性与野生型PE2的活性进行比较，我们设计了PEGRNA，它可以针对35个基因组基因座NGN PAM。PEGRNA建议使用引物结合位点（PBS）和RT模板（13 NT PBS和11〜14 NT RT模板）的长度，并经过随机设计以在目标基因组基因座中安装插入，缺失和取代。我们使用单链DNA组装方法8（补充注释1）更有效地构造了PegrNA。使用这些PEGRNA，我们检查了HEK293T细胞中六种PE2变体和野生型PE2的主要编辑活性（图1A-C和补充表1）。正如预期的那样，野生型PE2主要在NGG PAM站点（在9个站点中的7个活性，在UBE3A-3+5G> C位点上活跃，高达23.8％，在NGA PAM站点上有一定的认可（在9个地点的4个地点，最高22.9％的ATC and cut）和公共ng> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> （在8个站点中的0个中活跃）或NGT位点（在9个站点中的0个位置活跃）。相反，PE2-NG，PE2-SPG和PE2-SPRY变体可以编辑NGN位点（PE2-NG：在34个站点中的24个，PE2-SPG中有效，PE2-SPG：在35个站点中的26个站点中活跃，PE2-SPRY，PE2-SPRY：活动中的24个站点中的24个站点中的24个站点）。与先前的研究6，PE2-NG变体相比，NGC PAM位点的活性相对较低，与NGD相比（其中D是A，G或T）PAM位点，并且与其他PE2变体相比，PE2-SPG变体在NGH处显示出最高的活性（其中H是A，C，C，T）PEAM位点（其中PE2）在其他PE2变体中（Fige2 variant）（FIGINIANT（FIGINIANT）（FIGINIANT（FIGINING）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（图。1C和补充图1）。
piggyPrime：人类细胞中的高效 Prime 编辑......
基于 CRISPR-Cas9 系统的 Prime Editing（Jinek 等人，2012 年；Jinek 等人，2013 年；Ran 等人，2013 年）通过支持有针对性的插入、删除或 12 种可能的单碱基替换中的任何一种，实现基因组的精确编辑。通过 Prime Editing 进行的基因编辑既不涉及供体模板，也不涉及双链断裂（Anzalone 等人，2019 年）。Prime Editing 的这些独特属性基于 Prime Editor (PE) 的传递，该 Prime Editor 由 Cas9-逆转录酶融合蛋白（以下称为 PE2）以及 Prime Editing 向导 RNA（pegRNA）组成，后者指定基因组靶标以及要直接写入基因组的所需编辑。 Prime 编辑在治疗致病突变以及生成疾病模型（体外和体内）方面具有巨大潜力（Schene 等人，2020 年；Jang 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Liu 等人，2021 年；Park 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年；Qian 等人，2021 年）。然而，目前 Prime 编辑的使用受到低效率的挑战，导致需要耗费大量的优化和/或筛选方法才能实现令人满意的编辑效果（Liu 等人，2020 年；Schene 等人，2020 年；Chemello 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年）。将编码传统 CRISPR 效应物（如 Cas9 和单向导 RNA）的基因盒稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，已广泛应用于生命科学研究，包括用于生成模型细胞系和 CRISPR 筛选（Shalem 等人，2014 年；Holmgaard 等人，2017 年；Thomsen 等人，2020 年）。对于主要编辑，由于 PE2 编码序列较大（6351 bp），因此难以将 PE2 表达盒有效整合到哺乳动物细胞基因组中。由于包装能力有限，这使病毒载体的使用变得困难（Kumar 等人，2001 年），到目前为止，PE2 系统仅通过使用两个独立的慢病毒载体递送内含肽分裂 PE2 盒而整合到哺乳动物细胞基因组中（Anzalone 等人，2019 年）。这里我们介绍了 piggyPrime，这是一种非病毒单载体系统，可利用 piggyBac 转座子系统的强大整合能力，轻松高效地将所有主要编辑组件整合到人类细胞中。重要的是，DNA 转座促进的 PE2 和 pegRNA 的长期表达支持提高主要编辑水平，从而为有效转基因提供了一种新方法。
利用 prime 编辑系统高效生成小鼠模型
亲爱的编辑，人类的大多数遗传疾病是由单核苷酸突变引起的。尽管使用基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 1 或腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 2 进行基因组编辑对于某些遗传疾病中 C 到 T 和 A 到 G 碱基替换的基因校正大有希望 3,4，但这两种编辑器对于纠正其他变异（如碱基颠换、小插入和缺失 (indel)）均无效。prime editing 系统是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，最近被添加到基因组编辑工具包 5 中。prime editors (PEs) 结合了外源性 CRISPR/Cas9 系统和内源性 DNA 修复系统，以实现更大的编辑多功能性，诱导 CBE 和 ABE（C → T、G → A、A → G 和 T → C）之外的所有类型的碱基到碱基转换、小插入/缺失及其组合。基因组编辑系统从PE1进化到PE3（PE3b），效率逐步提高5。PE1的执行器由工程化的Cas9切口酶与逆转录酶（M-MLV RTase）5融合构建，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器结合工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。随后，在PE3b中，执行器与工程化的Cas9切口酶5融合，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器与工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）结合，寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。
人工智能生成的小活页夹改进了主要编辑
引物编辑 2 (PE2) 系统包含一个切口酶 Cas9，该切口酶与逆转录酶融合，利用引物编辑向导 RNA (pegRNA) 在目标基因组位点引入所需突变。然而，PE 效率受到错配修复 (MMR) 的限制，错配修复会切除包含所需编辑的 DNA 链。因此，通过显性负 MLH1 (MLH1dn) 的瞬时表达抑制 MMR 复合物的关键成分，PE 效率比 PE2 提高约 7.7 倍，从而生成 PE4。在此，通过利用生成人工智能 (AI) 技术 RFdiffusion 和 AlphaFold 3，我们最终生成了一种从头 MLH1 小结合物（称为 MLH1-SB），它与 MLH1 和 PMS2 的二聚体界面结合，以破坏关键 MMR 成分的形成。MLH1-SB 的尺寸很小（82 个氨基酸），因此可以通过 2A 系统将其整合到预先存在的 PE 架构中，从而创建一个新颖的 PE-SB 平台。结果，通过将 MLH1-SB 整合到 PE7 中，我们开发了一种改进的 PE 架构，称为 PE7-SB，它表现出迄今为止最高的 PE 效率（在 HeLa 细胞中是 PE2 的 29.4 倍，是 PE7 的 2.4 倍），这表明生成式 AI 技术将促进基因组编辑工具的改进。
肽融合提高主要编辑效率 1
Prime editing 是一种基于 CRISPR 的“搜索和替换”技术，可在没有双链断裂 (DSB) 或供体 DNA 模板 1 的情况下，在哺乳动物细胞中介导靶向 32 插入、删除和所有可能的碱基对碱基转换。Prime editing 34 酶 (PE2) 由与工程逆转录酶 (RT) 融合的 SpCas9 切口酶组成。35 PE2 通过 Prime editing 向导 RNA (pegRNA) 被招募到目标位点，该 RNA 除了标准基因组靶向间隔区和 SpCas9 结合发夹结构外，还包含 3' 序列，37 该序列充当融合 RT 的模板，以在一条切口 DNA 链上合成编程的 DNA 序列。当细胞 DNA 修复机制修复断裂的链时，这种 RT-39 延伸片段会与未编辑的片段竞争，而编辑后的序列有时会取代基因组中的原始序列 1,2。41
Prime编辑允许在负责Duchenne肌肉营养不良的基因中引入特定突变
摘要：从CRISPR/CAS9发现得出的主要编辑技术允许在特定基因中对选定的核苷酸进行修改。我们用它在外显子9、20、35、43、55和61中插入了特定的点突变，该基因肌营养不良蛋白编码为肌营养不良蛋白，该基因在DMD患者中不存在。分别用Prime Editor 2（PE2）和PE3获得了HEK293T细胞中DMD基因的11％和21％所需的突变。三种重复治疗将PE2的特定突变的百分比增加到16％。在单次治疗后，原始的邻接基序（PAM）序列中的额外突变提高了PE3结果至38％。我们还对患者成肌细胞中DMD基因的外显子6中的外显子6中的c.428 g>进行了校正。成肌细胞电穿孔分别显示高达8％和28％的修饰。成肌细胞校正导致通过蛋白质印迹检测到的肌管中肌营养不良蛋白的表达。因此，可以使用序数编辑来校正DMD基因中的点突变。
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，可以建立UPO
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，它基于我们先前开发的CRISPR-CAS9基因编辑平台。为大豆建造主要的编辑系统。基于SPCAS9 Nickase的两个不同变体和M-MLV的逆转录酶，已经为大豆毛的根和稳定的转化和基因组编辑制作了三个主要的编辑系统。分别使用命名为PE1，PE2和PE3的三个系统，以制造针对编码CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50的大豆基因的主要编辑构建体。PE1和PE2系统，以确定哪种最适合于创建精确的遗传变化，以改善大豆的性状。不幸的是，这两个系统无效地在毛状根中的四个CDPK基因中创建突变。因此，我们决定使用PE2系统测试其他基因FAD2和EPSP，并且再次没有发现靶基因已修改的证据。第三个Prime编辑版本，名为PE3，还测试了在毛状根部编辑FAD2和EPSP基因的能力，这也没有成功。PE1，PE2和PE3 PRIME编辑构建体在大豆中似乎不起作用，因此我们正在采用替代方法来修改向量，以使用不同的策略来生成Prime编辑指南RNA。这些结构将在下一个报告期间进行测试。总而言之，使用在其他工厂中使用的策略，在大豆中的主要编辑应用并不能有效。1。我们继续努力确定将在大豆中有效的主要编辑策略。目标2：应用基础编辑和主要编辑来修改影响大豆对干旱反应的基因。我们设计了两种不同的CRISPR-Cas9构建体来敲除CDPK基因的功能，这些功能被预测会影响大豆对干旱的反应。基于CRISPR-CAS9的基因敲除大豆CDPK家族基因（CDPK47、48、49和50）的两个CRISPR构建体（NK44和NK46）已建立，以敲除CDPK基因的两种组合。a。 NK44：PATEC-INCAS9-GCDPK49-50（靶向CDPK49和CDPK50）b。 NK46：PATEC-INCAS9-GCDPK47-50（靶向CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50）对这两种构建体进行了大豆转化，并为转染料的存在而基因型进行了基因型。我们为NK44构建体获得了四个转基因阳性植物。我们总共获得了NK46构建体的七个转基因阳性植物。种子，我们将这些种子称为T1代。至少为每条线发芽了至少24个T1幼苗，我们进行了PCR首先确定NK44或NK46构建体是遗传的，我们
具有不受束缚的逆转录酶和环状 RNA 模板的分裂引物编辑器
Es 可实现删除、插入和碱基替换而不会造成双链断裂 1 。然而，目前的 PE2、PE2* 和 PEmax 效应物（nCas9 与 Moloney 鼠白血病病毒 RT（M-MLV RT）的融合）1 – 3 > 6.3 千碱基 (kb)，超出了 AAV 的包装能力。高产量生产如此大的蛋白质或 mRNA（用于核糖核蛋白 (RNP) 或 RNA 递送）也是一项挑战。尽管一些拆分策略已用于递送 Cas9 相关基因组编辑工具 4 ，包括拆分内含肽 5 – 7 和 MS2（参考文献 8 – 10）或 SunTag 11 系链，但大多数拆分方法才刚刚开始应用于 PE 2、12、13。这些元素增加了 PE 系统的尺寸、分子复杂性以及生产和递送负担，并且限制了 PE 开发的组合吞吐量（即核酸酶和 RT 成分的混合和匹配）。pegRNA 优化对于有效的引物编辑也很重要。当前的 pegRNA 是一种结合 RNA，由 sgRNA 和包含 RT 模板 (RTT) 和引物结合位点 (PBS) 的 3′ 延伸组成。尽管在 PE 系统中整合 RNA 分子很简单，但由于 PBS 和间隔区之间不可避免的碱基配对以及潜在的 RTT-支架相互作用，它容易发生 RNA 错误折叠。最后，pegRNA 中的 3′ 末端延伸暴露在外，易受核酸酶降解，这可能会损害 pegRNA 的完整性。虽然 3′ 末端二级结构提高了 pegRNA 的稳定性 14 ，但仍需要进一步努力减少 pegRNA 的错误折叠和不稳定性。
ERC 评估小组和关键词
PE1_1 逻辑与基础 PE1_2 代数 PE1_3 数论 PE1_4 代数和复几何 PE1_5 李群、李代数 PE1_6 几何与全局分析 PE1_7 拓扑 PE1_8 分析 PE1_9 算子代数和泛函分析 PE1_10 ODE 和动力系统 PE1_11 偏微分方程的理论方面 PE1_12 数学物理 PE1_13 概率 PE1_14 统计学 PE1_15 离散数学与组合数学 PE1_16 计算机科学的数学方面 PE1_17 数值分析 PE1_18 科学计算和数据处理 PE1_19 控制理论与优化 PE1_20 数学在科学中的应用 PE1_21 数学在工业和社会中的应用 PE2 物质的基本构成 粒子、核、等离子体、原子、分子、气体和光学物理