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表征鼠催乳素中多个第一外显子的表征...
催乳素（PRL）受体（PRLR）基因在各个大脑区域表达，最高水平存在于脉络丛中，这是受体介导的PRL从血液到脑脊液流动的转运的位点。我们研究了PRL在鼠脉络丛中PRL基因表达的调节机制。我们首先研究了鼠Prlr基因中替代的第一个外显子的组织。除了三个已知的第一个外显子ME1 1，ME1 2和ME1 3，两个第一个外显子ME1 4和ME1 5还被cDNA克隆新近识别。PRLR mRNA的每个第一个外显子变体都表现出组织或通用表达。在小鼠的脉络丛中，与二肌小鼠中的小鼠相比，泌乳小鼠中ME1 3-，ME1 4-和ME1 5 -PRLR mRNA的表达水平增加。此外，与PRL差异（PRL c / c和prl c / k）小鼠相比，PRL（PRL K / K）小鼠的ME1 4-PRLR mRNA的表达水平降低。在卵巢切除的PRL K / K小鼠中，PRL给药的ME1 4 -PRLR mRNA的表达水平显着增加，但通过17 B-雌二醇给药。PRLR mRNA的最后两个外显子变体的表达水平，编码PRLR的长和短细胞质区域，在泌乳小鼠中也升高，并在PRL K / K小鼠中降低。这些发现表明，PRL通过ME1 4前外显子的转录激活刺激PRLR基因的表达，从而导致鼠脉络膜丛中PRLR mRNA的长形和短形式变体的增加。
生成针对双特异性抗体药物偶联物...
摘要 抗体药物偶联物（ADC）疗法已成为癌症免疫治疗中最有前途的方法之一。双特异性靶向可以提高 ADC 分子的特异性、亲和力和内化。催乳素受体（PRLR）和 HER2 在乳腺癌中存在串扰信号传导，与 HER2 相比，PRLR 经历了更快的内化。为了提高 HER2 ADC 的疗效并增强靶标特异性和内化，我们构建了 PRLR/HER2 靶向双特异性 ADC（BsADC）。我们从亲和力和内化方面评估了 PRLR HER2 BsADC 的表征，并使用 Cell Count Kit-8 分析进一步评估了其在人乳腺癌细胞系（BT474、T47D 和 MDA-MB-231）中的体外细胞毒性。我们的数据表明，PRLR HER2 BsADC 在结合药物后保持对两种靶向抗原的亲和力，并且与 HER2 ADC 相比表现出更高的内化效率。此外，PRLR HER2 BsADC 在体外对人类乳腺癌表现出优异的抗肿瘤活性。总之，我们的研究结果表明，通过增加靶向抗体的内化来增强抗肿瘤活性和治疗潜力是可行的，可以在体内动物模型中进一步评估。
将受精卵注射到牛胚胎中，对自然发生的序列变异进行基因组编辑
基因组编辑通过有针对性地引入天然序列变体，加速遗传增益，为改进当前的牛育种策略提供了机会。这可以通过在修复模板存在的情况下利用编辑器诱导的基因组切割后的同源性定向修复机制来实现。将基因组编辑器引入受精卵并在胚胎中进行编辑的优势在于，活体动物的发育不会受到影响，并且与当代基于胚胎的改良实践保持一致。在我们的研究中，我们调查了引入已知的前黑素体蛋白 17 ( PMEL ) 和催乳素受体 ( PRLR ) 基因的序列变体，并产生完全转化为精确基因型的非嵌合体编辑胚胎的潜力。将 gRNA/Cas9 编辑器注射到牛受精卵中以将 3 bp 缺失变体引入 PMEL 基因，可产生高达 11% 的完全转化胚胎。使用 TALEN 后，转化率提高到 48%，但前提是通过质粒递送。在几种已知 PRLR 序列变体、不同修复模板设计和 DNA、RNA 或核糖核蛋白传递的背景下测试三种 gRNA/Cas9 编辑器，实现了高达 8% 的完全转化率。此外，我们还开发了一种基于活检的非嵌合体胚胎筛选策略，该策略有可能专门生产具有预期精确编辑的非嵌合体动物。
杂交牛胚胎中催乳素受体基因外显子11存在多处突变
具有 SLICK 单倍型的牛具有光滑且短的毛发特征，SLICK 单倍型的主要优点之一是其在改善牛的体温调节方面发挥的作用，尤其是在炎热潮湿的气候下。导致牛出现光滑表型的致病变异主要位于催乳素受体基因的第 11 个外显子中，但应注意的是，并非在此区域发现的所有变异都会导致光滑表型（Porto-Neto 等人，Front. Genet.，9:57，2018）。尽管如此，这些单个等位基因对于 CRISPR 实验中的引导设计问题仍然至关重要，特别是那些旨在敲除或修改催乳素受体基因的实验。这些单个等位基因的鉴定有助于更全面地了解该区域的遗传变异，并可帮助研究人员为他们的实验设计更精确、更有效的引导 RNA。因此，即使不直接导致光滑表型的等位基因，在增进我们对与这一基本特征有关的潜在遗传机制的了解方面也具有重要价值。本研究旨在评估体外受精 (IVF) Bos taurus x Bos indicus 杂交牛胚胎的基因组序列，特别关注 PRLR 区域。单独收集囊胚，并使用两步孵育法用蛋白酶 K (1,5ug/uL) 裂解缓冲液进行 DNA 提取。随后，重复进行 PCR 扩增，并对 PCR 片段进行 Sanger 测序。使用 Unipro Ugene 软件进行序列分析 (Okonechnikov K., et al. Bioinformatics, 28 (8):1166-7, 2012)。共分析了 15 个样本，发现 33.3% (5/15) 的样本在位置 39099463 处出现单个突变 (C>T)，导致丝氨酸被替换为终止密码子，这是之前未曾报道过的。此外，在一个位置很近的区域中发现了一对错义突变，60% 的样本在位置 39099322 处出现精氨酸被替换为亮氨酸的突变 (G>T)，而所有样本在位置 39099190 处出现丝氨酸被替换为亮氨酸的突变 (C>T)。最后，在位置 39099368 处发现了一个静默突变，可能导致 60% 的样本中的胞嘧啶被胸腺嘧啶替换，在这两种情况下都会导致酪氨酸的合成。根据初步分析的结果，可以推断该区域具有较高的遗传变异潜力。因此，建议在设计旨在引入插入/缺失以促进光滑表型的向导 RNA 之前，检查杂交动物的目标基因组区域并与 Bos taurus 进行比较。总之，本研究的结果为了解牛 PRLR 区域的遗传变异提供了宝贵的见解，这可能会影响基因编辑效率。