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用于检测细胞内病原体毒力基因的多重 CRISPR 干扰工具
在没有靶标切割的情况下，催化失活的 dCas9 通过在空间上阻止 CRISPR (cr)RNA 指向的给定基因上的 RNA 聚合酶活性来施加转录基因抑制。这种基因沉默技术称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi)，已用于各种细菌物种以检测基因，主要是单独或成对检测。在这里，我们在病原体 Legionella pneumophila 中开发了一个多路复用 CRISPRi 平台，能够同时沉默多达十个基因。通过将强进行性启动子与重复/间隔序列上游的 boxA 元素相结合，克服了 Rho 依赖性转录终止对前体 crRNA 表达的限制。使用针对毒力蛋白编码基因的 crRNA，我们证明 CRISPRi 不仅在无菌培养基中生长期间完全发挥作用，而且在巨噬细胞感染期间也完全发挥作用，并且 CRISPRi 的基因耗竭完全重现了缺失菌株的生长缺陷。重要的是，通过改变重复/间隔序列中 crRNA 编码间隔序列的位置，我们的平台实现了目标的逐渐消耗，这反映在表型的严重性上。因此，多重 CRISPRi 有望用于大量探测大量基因，以破译 L. pneumophila 和其他细菌病原体的毒力策略。
对靶向抗纤维化治疗的肺纤维发生过程中巨噬细胞的机械激活
抽象的肺纤维化，如特发性肺纤维化（IPF）和共vid诱导的肺纤维化，是一种通常致命的肺部疾病。显示出巨噬细胞等免疫细胞数量增加会在纤维化肺中积聚，但目前尚不清楚它们如何促进纤维化的发展。为了概括纤维化肺组织微环境中的巨噬细胞机械激活，我们开发了一种具有共培养的人类巨噬细胞和成纤维细胞的纤维化微动物模型。我们表明，在地形控制的基质组织构建体上播种的纤维巨噬细胞被机械地激活。巨噬细胞，胶原蛋白纤维和成纤维细胞的共对象促进了微工程肺组织中广泛的纤维发生。使用吡非酮的抗纤维化处理破坏了纤维化巨噬细胞的极化和机械激活，从而导致纤维化抑制。pirfenidone通过抑制整合素αMβ2（CD11b/CD18）和Rho相关激酶2来抑制巨噬细胞的机械激活，这是先前未知的药物作用机理。一起，这些结果证明了在组织水平上具有机械活化巨噬细胞的组织水平的潜在肺纤维发生机制。我们提出了共培养物，将力感应微动物模型作为研究复杂的免疫细胞相互作用和抗纤维化药物作用机理的强大工具。
Belanio 等人：当地 YouTube 旅行视频博客与 DLSU-D 旅游学生重游意愿之间的关系。
摘要。多年来，旅行视频博客的数量一直在增加。旅行视频博客已成为旅行者获取旅游信息的重要途径，这会影响观看者的旅行意图。这项定量研究通常考察当地 YouTube 旅行视频博客与德拉萨大学达斯马里尼亚斯分校旅游专业学生重游意向偏好之间的显著关系。这项研究的出现是因为之前的研究探讨了旅行视频博客与游客旅行意向之间的关系。通过调整属性和特征，本研究的结果可以作为观看旅行视频博客与学生重游意向的本质基础。数据是使用 Microsoft Forms 构建的在线问卷收集的。德拉萨大学达斯马里尼亚斯分校的两 (2) 名旅游学教授和一名统计学家验证了问卷。使用加权平均值和 Spearman 的 Rho 分析结果。此外，研究的总体结果显示变量之间存在很强的相关性。最后，研究得出结论，当地 YouTube 旅行视频博客与德拉萨大学达斯马里尼亚斯分校旅游专业学生的重游意向偏好之间存在显著关系。关键词：YouTube 旅行视频博客、重游意向、旅行行为、旅行体验
胆管消失综合征中巨噬细胞上 S1PR2 的激活和肝细胞 S1PR2/RhoA/ROCK1/MLC2 通路
免疫性胆管破坏是肝移植和造血干细胞移植后胆管消失综合征 (VBDS) 的一种致病性疾病。由于胆汁酸受体鞘氨醇 1-磷酸受体 2 (S1PR2) 在将骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞募集到胆汁淤积性肝损伤部位方面起着关键作用，因此使用培养的巨噬细胞和患者组织检查了 S1PR2 的表达。胆小管破坏先于肝内胆管减少；因此，我们使用形成明显胆小管状网络的三维肝细胞培养模型，重点研究肝细胞 S1PR2 和下游 RhoA/Rho 激酶 1 (ROCK1) 信号通路和胆小管改变。多重免疫组织化学显示，与正常肝脏相比，由于移植物抗宿主病和肝移植后排斥反应导致胆管减少的肝组织中 S1PR2 + CD45 + CD68 + FCN1 + 炎性巨噬细胞和 S1PR2 + CD45 + CD68 + MARCO + 库普弗细胞的数量增加。抑制 S1PR2 后，巨噬细胞表达的促炎细胞因子（包括 MCP1）减少。牛磺胆酸和 S1P2 激动剂诱导肝细胞 S1PR2 并降低 RhoA/ROCK1 表达，导致胆小管扩张。抑制 S1PR2 可逆转对 RhoA/ROCK1 表达的影响，从而通过肌球蛋白轻链 2 (MLC2) 磷酸化维持胆小管。巨噬细胞上的 S1PR2 和肝细胞上的 S1PR2 的激活可能会通过 MLC2 磷酸化破坏受 RhoA/ROCK1 调控的 VBDS 中的胆汁小管动力学。
对波兰空中交通管制员和海上导航员群体的感知压力、倦怠综合症和自我效能的探索：相似之处和不同之处
摘要：背景：这项横断面研究旨在评估波兰海上航行员和空中交通管制员群体的感知压力和职业倦怠水平。该研究是对被认为同样承受情感负担的职业群体进行研究的一部分。我们测试了将职业倦怠、感知压力和资历联系起来的模型的可用性。方法：将一组问卷（包括链接倦怠问卷、感知压力量表-10 和广义自我效能量表）分发给 54 名海上航行员和 88 名空中交通管制员（回报率：18-56%）。使用了 Spearman 的 rho、χ2 检验、Mann-Whitney U 检验、Cohen 的 d 和 Hedge 的 g 系数、线性回归和 F 统计量。结果：假设从事具有特殊专业要求的职业（如空中交通管制员和海上导航员）的人，在面临强烈、慢性情绪超负荷风险时，会认为自己的生活状况比其他员工压力小，这一假设得到了证实。管制员和导航员组的职业倦怠程度高于同样情绪负担沉重的波兰货运飞行员组，但波兰精神病学家并非如此。研究组在压力来源方面存在差异：空中交通管制员组害怕无助，海上导航员组无法克服逆境。海上导航员报告的职业倦怠程度更高
利用针对细胞蛋白的化合物抑制人类巨细胞病毒复制
收到日期：2022 年 7 月 12 日；接受日期：2022 年 8 月 29 日；发布日期：2022 年 10 月 10 日 作者隶属关系：1 伦敦大学圣乔治学院感染与免疫研究所，英国伦敦。 * 通讯作者：Blair L. Strang，bstrang@sgul.ac.uk 关键词：青蒿素；化合物；巨细胞病毒；药物；激酶；重新利用；筛选；病毒。 缩写：CLK2，细胞周期蛋白依赖性激酶样激酶 2；CREB，cAMP 反应结合蛋白；DYRK1A、DYRK1B、DYRK2，双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶 1A、1B 和 2。；GCV，更昔洛韦；HCMV，人类巨细胞病毒； HIPK1 和 HIPK4，同源域相互作用蛋白激酶 1 和 4；HIV，人类免疫缺陷病毒；IE，立即早期；MAP4K4，丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 4。；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；MIEP，主要立即早期启动子；MNK，MAP 激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；MSK1，丝裂原和应激激活激酶 1；PKA，蛋白激酶 A；PLK1，polo 样激酶 1；PRKD1、PRKD2 和 PRKD3，蛋白激酶 D1-D3；PRKG1、PRKG2，cGMP 依赖性激酶 1 和 2；PRKX，蛋白激酶，x 连锁。； ROCK1、ROCK2、rho 相关、卷曲螺旋蛋白激酶 1 和 2；SARS-CoV-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒 2；SLFN11、Schlafen 蛋白 11；VGCV、缬更昔洛韦。001795 © 2022 作者
相对 qPCR 定量分析丛枝菌根真菌对植物根系的定植
摘要 丛枝菌根真菌 (AMF) 是一种有益的土壤真菌，可以促进宿主植物的生长。准确量化植物根部中的 AMF 非常重要，因为定植水平通常可以表明这些真菌的活性。根定植传统上用显微镜方法测量，该方法可以看到根内的真菌结构。显微镜方法劳动密集型，结果取决于观察者。在本研究中，我们提出了一种相对 qPCR 方法来量化 AMF，其中我们根据植物基因标准化了 AMF qPCR 信号。首先，我们在计算机上验证了引物对 AMG1F 和 AM1，并表明这些引物涵盖了植物根部存在的大多数 AMF 物种，而不会扩增宿主 DNA。接下来，我们基于对矮牵牛植物的温室实验将相对 qPCR 方法与传统显微镜检查进行了比较，这些植物的 AMF 根定植水平从非常高到非常低不等。最后，通过使用 MiSeq 对 qPCR 扩增子进行测序，我们通过实验证实引物对排除了植物 DNA，而主要扩增了 AMF。最重要的是，我们的相对 qPCR 方法能够区分 AMF 根定植的定量差异，并且与传统显微镜定量结果高度相关（Spearman Rho = 0.875）。最后，我们对显微镜和 qPCR 方法的优缺点进行了平衡的讨论。总之，测试的相对 qPCR 方法提供了一种可靠的替代方法来量化 AMF 根定植，与传统显微镜相比，该方法对操作员的依赖性更低，并且可扩展到高通量分析。
MicroRNA-126-3p 抑制 HeLa 细胞增殖，...
摘要。我们之前曾报道，与正常宫颈粘液相比，microRNA 126-3p (miR-126-3p) 在患有明显宫颈癌或癌前病变的患者的宫颈粘液中的含量明显更高。在本文中，我们研究了在宫颈癌细胞系 HeLa 中强制表达 miR-126-3p 对增殖、迁移、侵袭、凋亡和蛋白质表达的影响。我们用 miR-126-3p miRNA 转染 HeLa 细胞，发现这些细胞的增殖、迁移和侵袭（通过细胞计数、伤口愈合、细胞迁移和侵袭测定）相对于用阴性对照模拟物转染的细胞显著降低。在 miR-126-3p 转染的细胞中，磷酸肌醇 3 激酶 (PI3K)、磷酸化 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 (p-PDK1) 和 p-AKT 蛋白的水平较低。磷酸化 70S6K (p-p70S6K)、磷酸化糖原合酶激酶 3 β (p-GSK3 β )、磷酸化 S6K (p-S6K)、细胞周期蛋白 D1、磷酸化 p21 活化激酶 1 (p-PAK1)、Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶 1 (ROCK1)、肌强直性营养不良相关 CDC42 结合激酶 α (MRCK α ) 和磷脂酶 C γ 1 (p-PLC γ 1) 也下调。这表明 PI3K/PDK1/AKT 通路的下游效应子是 miR-126-3p 抑制的靶标。相反，凋亡相关蛋白，包括 BCL-2 相关细胞死亡激动剂 (Bad)、B 细胞淋巴瘤特大 (Bcl-xL) 和 BCL-2 相关 X (Bax)，均被 miR-126-3p 上调，导致 caspase 3/7 活性增加和细胞凋亡。因此，miR-126-3p 的强制表达
Trp56 与其生物活性的相关性
近年来，肿瘤学新药的开发取得了显著进展。特别是，药物开发已从活性细胞毒性化合物的经验筛选转变为阻断驱动癌症进展和转移的特定生物途径的分子靶向药物。通过合理的设计方法，我们的团队开发了 1A-116 作为一种有前途的 Rac1 抑制剂，在几种类型的癌症中具有抗肿瘤和抗转移作用。Rac1 在多种肿瘤类型中过度激活，它是 Rho GTPase 家族中研究最多的蛋白质之一。它在肌动蛋白细胞骨架重组中的作用对内吞作用、囊泡运输、细胞周期进程和细胞迁移有影响。在这种情况下，Rac1 的调节活性影响癌症过程中的几个关键过程，包括侵袭和转移。这项临床前研究的目的是重点研究 1A-116 的作用方式，采用跨学科方法，使用计算机生物信息学工具和体外测定。在这里，我们证明色氨酸 56 残基对于 1A-116 的抑制作用是必需的，因为这种化合物会干扰涉及几种 GEF 激活剂的 Rac1GTPase 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)。1A-116 还能够抑制致癌 Rac1 P29S 突变蛋白，这是在日光暴露黑色素瘤中发现的致癌驱动因素之一。它还抑制许多 Rac1 调节的细胞过程，例如膜皱褶和板状伪足形成。这些结果加深了我们对 1A-116 对 Rac1 的抑制及其对癌症进展的生物学影响的了解。它们也是一个很好的例子，说明计算机分析如何成为一种有价值的药物开发方法。
论文模板
ATP ATP腺苷-5'-三磷酸凸轮钙调蛋白CARQ CAQ+激活的Rho蛋白，带有嵌入的IQP Ceru ceru cerulean，相当于CFP CFP CFP CyAn荧光蛋白 Dulbecco's modified eagle medium FBS Fetal Bovine Serum FKBP12 12-kDa FK506 and rapamycin-binding protein FRB FKBP-rapamycin binding domain FRET Fluorescence resonance energy transfer GST Glutathione S-transferase His Polyhistidine-tag IRES Internal ribosomal entry site LB Luria Broth LOV Light-oxygen-voltage域，lov2域Lovs1K Lov2结构域与刺激1 c末端碎片MCS多个克隆位点MLCKP肌球蛋白轻链激酶激酶肽MRFP单体红色荧光蛋白相当于RFP，相当于RFP NES核出口NLS NLS NLS信号NLS信号NLS核定位PBS PBS PBS磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐酶磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐反应pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu pdbu PKC Protein kinase C pLyn Palmitoylation sequence of Lyn kinase RFP Red fluorescent protein, equivalent to mRFP SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SH3 SRC Homology 3 Domain TEV Tobacco etch virus TEVp Tobacco etch virus protease TS Temperature-sensitive tsTEVp Temperature-sensitive tobacco蚀刻病毒蛋白酶tvmvp烟草静脉斑点病毒蛋白酶蛋白酶ven venus，相当于YFP YFP YFP黄色荧光蛋白，相当于Ven