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通过 Cas9 介导的 ReMOT 控制对 Chagas 病媒介 Rhodnius prolixus 进行基因编辑
。CC-BY 4.0 国际许可证下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2023 年 8 月 15 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.08.14.553172 doi：bioRxiv 预印本
利用 ReMOT 控制对中华按蚊进行高效基因编辑 杨小林 1+ ，凌霞 1+ ，孙泉 2+ ，邱频频 1 ，项凯 1 ，
利用 ReMOT 控制实现中华按蚊的高效基因编辑 杨晓林 1+、凌霞 1+、孙泉 2+、邱品品 1、项凯 1、洪俊峰 1、何树林 1、陈杰 3、丁鑫 3、胡海 3、何正波 1、周曹 1*、陈斌 1*、乔梁 1* 1 重庆师范大学生命科学学院昆虫与分子生物学研究所，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆 401331。 2 重庆市巡检生命科技有限公司，重庆 400700。 3 西南大学资源昆虫国家重点实验室，重庆 400715 论文标题：中华按蚊的 ReMOT 控制 + 同等贡献。 * 通讯作者。电子邮箱：qiaoliangswu@163.com; zhouc@cqnu.edu.cn; bin.chen@cqnu.edu.cn 摘要：CRISPR/Cas9 基因编辑为揭示蚊子发育和蚊媒疾病传播的分子机制以及探索遗传控制策略提供了一种有效的方法。然而，将 Cas9
通过胚胎注射和 ReMOT 控制对黑腿蜱（Ixodes scapularis）进行 Cas9 介导的基因编辑
摘要 尽管蜱虫能够获得和传播多种致病病原体，但对蜱虫的研究却落后于蚊子等其他节肢动物媒介，这主要是因为在应用现有的遗传和分子工具方面存在挑战。CRISPR-Cas9 正在改变非模式生物研究；然而，尚未有蜱虫成功进行基因编辑的报道。注射蜱虫胚胎进行基因编辑的技术挑战进一步减缓了研究进展。目前，尚无针对任何螯合动物物种（包括蜱虫）的胚胎注射方案。在此，我们报告了一种针对黑腿蜱（Ixodes scapularis）的成功胚胎注射方案，以及使用此方案通过 CRISPR-Cas9 进行基因组编辑。我们还证明 ReMOT 控制技术可成功用于在昆虫纲之外产生基因组突变。我们的研究结果为蜱研究界提供了创新工具，对于促进我们对蜱虫传播病原体的分子机制以及宿主-媒介-病原体相互作用的潜在生物学的理解至关重要。
ReMOT 控制递送 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物以诱导疾病媒介蚊子淡色库蚊的种系诱变
淡色库蚊复合体分布广泛，导致蚊媒疾病在人类中的传播难以预防。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑是一种有效的技术，有可能解决日益严重的蚊媒疾病问题。本研究利用 ReMOT 控制技术在淡色库蚊中生产转基因蚊子。通过注射 60 只成年雌蚊建立了显微注射系统——需 14 µ l 注射混合物，使用≤1 µ l 的内体释放试剂（氯喹或皂苷）不会发生沉淀。在采血后 24 小时（卵黄发生高峰期）注射 P2C 增强型绿色荧光蛋白-Cas9（P2C-EGFP-Cas9）核糖核蛋白复合物进入卵巢的效率为 100%。利用此方法进行KMO敲除，我们发现当通过ReMOT Control将P2C-Cas9 RNP复合物注射到淡色库蚊成年血淋巴中时，卵巢中也能发生基因编辑。在氯喹组，筛选出的2,251只G 0 子代中，9只个体表现出白眼和马赛克眼表型。在皂苷组，筛选出的2,462只G 0 子代中，观察到8只突变个体。测序结果显示13 bp的缺失，进一步证实了发生基因编辑的事实。总之，ReMOT Control在淡色库蚊中的成功应用，不仅为该方法提供了基本参数（注射参数和注射时间），而且有利于蚊虫生物学和防治的研究。
通过 ReMOT 控制对疟蚊 Anopheles stephensi 进行 Cas9 介导的基因编辑
摘要 创新工具对于推进疟疾控制至关重要，并且取决于对疟蚊传播疟原虫的分子机制的理解。基于 CRISPR/Cas9 的基因破坏是一种揭示媒介-病原体相互作用的潜在生物学原理的有效方法，其本身可以成为蚊虫控制策略的基础。然而，用于对蚊子（尤其是疟蚊）进行基因改造的胚胎注射方法既困难又低效，特别是对于非专业实验室而言。在这里，我们采用了 ReMOT 控制（受体介导的卵巢货物转导）技术，将 Cas9 核糖核蛋白复合物递送至成年蚊子卵巢，从而无需注射胚胎就在疟疾媒介斯氏疟蚊中产生有针对性的可遗传突变。在疟蚊中，ReMOT 控制基因编辑与标准胚胎注射一样有效。 ReMOT 控制对按蚊的应用，为缺乏设备或专业知识进行胚胎注射的疟疾实验室揭示了 CRISPR/Cas9 方法的威力，并建立了 ReMOT 控制对不同蚊子物种的灵活性。