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改变蛋白-DNA相互作用在复制起源许可期间促进ORC结合位点交换
在ORC和BPR之间作为“ ORC-BPR”相互作用（图1a，第一个面板，虚线框）。使用总内反射荧光（TIRF）显微镜，我们监测了溶液与表面束缚的原点DNA中的ORC C的共定位（23）。在每个ORC-DNA共定位事件中，我们测量了有效的ORC C•+51 FRET效率（E FRET）以检查ORC诱导的DNA弯曲。当兽人到达DNA时，我们一直观察到高兽人C•+51 e fret状态，表明兽人与ACS和BPR结合，并且绑定的DNA弯曲（图。1C-D）。大多数ORC C•+51 E FRET值以0.62为中心（图1d）。尽管它们代表兽人共定位时间的0.5％，但我们还观察到了较低的E fret值的短期（<0.28，图。1C-D，SI附录，图 s1b）。 这些低E FRET值不是由光漂白引起的，因为我们在实验后通过受体激发检查了DNA耦合的荧光团，并将分析限制为将荧光保持到实验结束的DNA分子。 此外，对照实验表明，这些低E fret值不是由沿着DNA滑动而引起的，以远离ACS（SI附录，图。 s2）。 我们排除了在DNA共定位期间任何时候都没有显示高E FRET信号的小部分（约2％）的兽人分子，因为这些可能代表了非特异性的ORC结合。 单个高斯模型在低E fret值下的差（图） 1b）。1C-D，SI附录，图s1b）。这些低E FRET值不是由光漂白引起的，因为我们在实验后通过受体激发检查了DNA耦合的荧光团，并将分析限制为将荧光保持到实验结束的DNA分子。此外，对照实验表明，这些低E fret值不是由沿着DNA滑动而引起的，以远离ACS（SI附录，图。s2）。我们排除了在DNA共定位期间任何时候都没有显示高E FRET信号的小部分（约2％）的兽人分子，因为这些可能代表了非特异性的ORC结合。单个高斯模型在低E fret值下的差（图1b）。1d，插图中的红色曲线表明在弯曲或无形构象状态下存在不同的种群。我们得出的结论是，低E fret值反映了一个无分的状态，其中兽人在ACS处保持绑定，但兽人相互作用丢失（图添加Cdc6会提高DNA上的ORC稳定性，从而导致
软tick中的微生物群驱动疫苗
如此高度蓝色的SIV发射线提出了有关其起源的审讯。到目前为止，有人建议这些蓝线可能起源于新的基于硅的缺陷[1]。我们认为它们起源于受到强量子电动力效应的SIV中心。为了支持这一主张，我们研究了在SIV发光光谱中观察到的声子侧带。图s1a，我们比较了单个SIV缺陷的室温发射光谱（蓝色曲线），并在k（粉红色曲线，[2]中获取的数据8）中获得的室温（蓝色曲线）[2-7]。引人注目的相似性，并且可以绘制振动模式之间的直接对应关系。根据在实验曲线上执行的分解多洛伦兹拟合，侧带特征位于MEV，MEV，MEV，MEV，MEV，MEV和〜43 〜43 〜75 〜92 〜92 〜92 〜143 〜143 〜156 MEV相对于ZPL（见图。s1b）。频谱显示出与大约166个幅度和宽度相同的模式，但由于应变诱导的变形而在位置移动。
基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editing 是一种近期出现的精确基因组编辑方式，其多功能性为包括靶向基因疗法开发在内的广泛应用提供了前景。然而，其优化和使用的一个突出瓶颈是难以将大型 prime 编辑复合物递送到细胞中。在这里，我们证明将 prime 编辑构建体包装在腺病毒衣壳中可以克服这一限制，从而在转化和非转化的人类细胞中实现强大的基因组编辑，效率高达 90%。使用这种不依赖细胞周期的递送平台，我们发现 prime 编辑活动与细胞复制之间存在直接相关性，并揭示了准确的 prime 编辑事件与不需要的副产物之间的比例可能受靶细胞环境的影响。因此，腺病毒载体颗粒允许在人类细胞中有效地递送和测试 prime 编辑试剂，而与它们的转化和复制状态无关。本文整合的基因传递和基因编辑技术有望帮助研究在众多实验环境中以及最终在体外或体内治疗环境中进行主要编辑的潜力和局限性。简介基于序列可定制的向导 RNA (gRNA) 和 CRISPR 相关 (Cas) 核酸酶的可编程核酸酶是强大的基因组编辑工具 (1,2)。然而，除了脱靶诱变 (3-9) 之外，可编程核酸酶通常会因非法重组过程修复双链断裂 (DSB) 而产生复杂的靶等位基因破坏和大规模基因组重排 (10,11)。因此，最近的基因组编辑发展包括从 DNA 切割发展到基于切口 Cas 蛋白本身 (12–14) 的 DNA 非切割技术，或基于这些与 DNA 修饰部分融合的 RNA 可编程切口酶，例如碱基编辑器和最近的 prime editors (15,16)。Prime 编辑允许安装任何单个碱基对替换以及明确定义的小插入或删除，同时不需要 DSB 或供体 DNA 底物 (15)。Prime editors 由扩展的 gRNA 和 Cas9 H840A 切口酶组成，它们与工程逆转录酶 (RT) 融合，分别命名为 pegRNA 和 PE2 (补充图 S1A)。pegRNA 由 3' 端共价连接到编码目标编辑的 RT 模板和 RT 引物结合位点 (PBS) 的 gRNA 形成。位点特异性基因组 DNA 切口产生 3' 端 DNA 瓣，经 PBS 退火后，在 RNA 模板上引发 RT 介导的 DNA 合成。PE2 和 PE3。DNA 拷贝杂交至互补靶 DNA 后，编辑最终通过连续链解析反应整合到基因组中（补充图 S1B）。Prime 编辑有两种主要方式，即前者系统需要传递 PE2：pegRNA 复合物；后者依赖于这些复合物与传统 gRNA 一起转移。在 PE3 系统中，gRNA 指导的未编辑 DNA 链切口促进了使用编辑链作为修复模板（补充图 S1B）。尽管 Prime 编辑原理具有巨大的潜力和多功能性，但仍存在一些需要识别、仔细评估和解决的特定缺陷。大型的 Prime 编辑核糖核蛋白复合物由 ∼ 125 个核苷酸长的 pegRNA 和由 6.3 kb ORF 编码的 238 kDa 融合蛋白组成，这带来了巨大的生产和交付问题。事实上，生产足够数量的 >100 kDa 蛋白质尤其具有挑战性。此外，尽管病毒载体是最有效的基因组编辑工具递送系统之一 (17)，但最常用的平台基于 ∼ 15 nm 腺相关病毒 (AAV) 颗粒，由于其包装容量有限（∼ 4.7 kb）（17），不适合转移全长 Prime 编辑序列。完全病毒基因删除的腺病毒载体（也称为高容量腺病毒载体），以下称为腺载体颗粒 (AdVP)，聚集了一组有价值的特征，即； (i) 大包装容量（即高达 36 kb），(ii) 严格的游离性，(iii) 高遗传稳定性；(iv) 容易的细胞趋向性改变和 (v) 高效转导分裂和静止细胞 (17–21)。在这里，我们研究了定制这些 ∼ 90 nm 生物纳米粒子用于全长主要编辑组件的一次性转移的可行性和实用性，并且由于潜在或影响主要编辑结果的细胞过程基本上是未知的，利用后一个特性来研究细胞周期对这种位点特异性 DNA 修饰原理的作用。材料和方法 细胞
粘合素超元在循环挤出过程中DNA
抽象的粘着蛋白将基因组DNA挤压成促进染色质组装，基因调节和重组的环。在这里，我们表明粘着蛋白将负超胶引入挤出的DNA中。超螺旋需要粘蛋白的ATPase头，这些头部夹紧DNA以及在粘蛋白的铰链上的DNA结合位点，表明在铰链和夹具之间约束粘蛋白超侧Coil DNA。我们的结果表明，一旦粘蛋白在超涂层期间达到其失速扭矩，DNA挤出会停止，而粘蛋白突变体预测会停滞在较低的扭矩形成细胞中的较短环。这些结果表明，超涂层是环挤出机制的组成部分，并且粘着蛋白不仅通过循环DNA，而且通过将其超级旋转来控制基因组结构。真核间相细胞中的主要文本，SMC（“染色体的结构维持”）复合粘着蛋白将基因组DNA折叠成环和拓扑结构域（TADS;参考（1-4）），可以调节转录（5），重组（6，7），姐妹染色单体分离（8）和复制（9）。粘着蛋白通过由ATP结合 - 水溶液周期控制的构象变化（12）（在（13）中进行了综述），将DNA挤压为环（10，11）。这些是由粘蛋白的SMC1和SMC3亚基催化的，其中包含50 nm长的盘绕螺旋，二聚体“铰链”结构域和球形ATPase'heads'（图s1a），与ABC转运蛋白相关（14）。在ATP结合后，粘蛋白的头部接合和一个称为NIPBL“夹具” DNA的亚基在接合的ATPase头顶上（参考（12，15-17）;如图。s1b）。这些动作产生〜15 pn力（18）和循环挤出步骤〜40 nm（100-200 bp;ref。（19）），表明在头部互动过程中将DNA卷入形成循环中。相比之下，在环挤出过程中DNA的构象变化知之甚少。拓扑异构酶II在粘着蛋白环的底部结合并切割DNA（20-23），这表明DNA在这些位点上是超螺旋的。有丝分裂SMC复合物冷凝蛋白还与拓扑异构酶（24-30）共定位并相互作用，并且可以在体外超涂DNA（31-33）。已经提出了此过程发生在循环挤出过程中（31，33），但发现粘着蛋白不适合