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CRISPR/CAS9介导的突变铜转运蛋白ATP7B
Wilson病（WD）是一种基于ATP7B基因突变的单基因肝病，导致肝脏中铜（CU）的功能恶化。多余的Cu积聚在肝脏和大脑等各种器官中。WD患者显示出临床异质性，其范围从急性或慢性肝衰竭到神经系统症状。在大多数患者中用锌或螯合剂（例如D-苯胺胺）的终身治疗可以改善这种疾病的病程，但是在大部分患者中已经观察到了严重的副作用，例如神经系统恶化和肾脏毒性，因此不可避免地是肝移植。替代疗法选择是对ATP7B基因的遗传校正。最近在诊所中使用的新型基因治疗方法CRISPR/CAS9可能代表了合适的治疗机会。在这项研究中，我们首先使用CRISPR/CAS9基因编辑在人类细胞系中启动了人造ATP7B点突变，并通过额外使用单链寡核心DNA核苷酸（SSODN）来纠正该突变，从而模拟了VITRO中A WD点突变的基因校正。通过在唇彩后三天添加0.5 mm的Cu，可实现CRISPR/CAS9介导的ATP7B修复的细胞克隆的高收率（60％）。此外，使用结合了三个阻断突变的SSODN提高了修复效率。经过修复的细胞克隆在暴露于Cu浓度升高后对CU具有高抗性。我们的发现表明CRISPR/CAS9介导的ATP7B点突变的校正是可行的，并且可能有可能转移到诊所。
RNA 引导的 AsCas12a 和 SpCas9 催化敲除...
寡核苷酸和基于序列的试剂 PCR 引物 本研究 从 IDT ssODN 合成 Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 Ultramer DNA Oligos， 从 IDT 合成向导 RNA Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 从 IDT 合成 化学品、酶和其他试剂 Alt-R® CRISPR-Sp HiFi Cas9 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081060 Alt-R® CRISPR-AsCas12a 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081068 DNAzol® ES 试剂 Molecular Research Center DN127 RNAzol® RT 试剂 Molecular Research Center RN190 Opti-MEM FisherScientific Gibco™ 31985062 DMEM FisherScientific 88364 胎牛血清 FisherScientific Gibco™ 26140079 100x 青霉素-链霉素-两性霉素 B FisherScientific SV30079.01 NucleoSpin® 凝胶和 PCR 纯化 Takara 740609
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为了访问这些优化的基因组编辑方法，我们创建了Invitrogen™Truedesign™基因组编辑器，这是一种免费的在线工具，用于设计和订购基于CRISPR-Cas9的编辑。本申请说明描述了两种用例：（1）引入诱导多能干细胞（IPSC）（IPSC）和（2）用GFP标记β-肌动蛋白的LRRK2基因（G2019S）中的SNP变化。对于SNP变化，通过在线工具自动生成了单链寡核苷核苷酸（SSODN）供体的建议设计。对于融合蛋白，使用Invitrogen™TRUETAG™供体DNA试剂盒自动生成底漆建议，以自动生成双链供体DNA。供体DNA。此应用程序说明还描述了此转染过程的详细协议。一旦输送到细胞中，供体DNA将在不到一天的时间内将其集成到目标细胞的基因组中。
通过细胞周期和 DNA 修复调节在人类 iPS 细胞中进行协同基因编辑
精准基因编辑旨在生成单核苷酸修饰以纠正或模拟人类疾病。然而，由于效率低下和实用性有限，使用 CRIPSR-Cas9 等核酸酶进行精准编辑的成功率有限。在这里，我们在人类诱导多能干细胞 (iPS) 中建立了荧光 DNA 修复检测，以可视化和量化单等位基因和双等位基因靶向期间 DNA 修复结果的频率。我们发现，通过确定的培养条件和小分子调节 DNA 修复和细胞周期阶段可协同增强同源定向修复 (HDR) 的频率。值得注意的是，在纯合报告细胞中进行靶向可产生高水平的编辑，其中绝大多数为双等位基因 HDR 结果。然后，我们利用高效的双等位基因 HDR 和混合 ssODN 修复模板来产生杂合突变。协同基因编辑是产生人类 iPS 细胞中精确基因修饰的有效策略。
囊性纤维化患者细胞中的 P.F508del 编辑
基因组编辑方法的发展为基于病因的遗传性疾病治疗方法的开发创造了新的机遇。在这里，我们证明 CRISPR/Cas9 可以纠正囊性纤维化 (CF) 患者来源的 CFTE29o- 细胞和诱导多能干细胞 (iPSC) 中 CFTR 基因的 p.F508del 突变。我们使用了 Cas9、sgRNA 和 ssODN 的几种组合，并测量了内源性 CFTR 基因和含有 p. F508del 突变 CFTR 基因座的共转染质粒的编辑效率。CFTE29o- 细胞中 CFTR 基因中的非同源末端连接 (NHEJ) 频率从等位基因的 1.25% 到 2.54% 不等。内源性 CFTR 基因座中最好的同源定向修复 (HDR) 频率为等位基因的 1.42%。在 iPSC 中，CFTR 基因中的 NHEJ 频率从等位基因的 5.5% 到 12.13% 不等。HDR 效率最高的是等位基因的 2.38%。我们的结果表明，在 CF 患者来源的 iPSC 中使用 CRISPR/Cas9 进行 p.F508del 突变编辑是一种相对罕见的事件，应进行后续细胞选择和培养。
干细胞研究
SPG11 中的双等位基因致病变异编码了 spatacsin，可导致罕见的运动神经元疾病，如遗传性痉挛性截瘫 11 型 (SPG11-HSP)、夏科-马里-图斯病和青少年型肌萎缩侧索硬化症-5 (ALS5)。SPG11-HSP 是最常见的复杂常染色体隐性 HSP。除了下肢痉挛和截瘫外，SPG11-HSP 患者还存在其他症状，如认知能力下降、上肢无力和周围神经病变（Pozner et al., 2020）。SPG11 编码一种 ~280 kDa 的蛋白质，称为 spatacsin，其参与自噬溶酶体机制的功能和囊泡运输。然而，由于缺乏特异性抗体，spatacsin 的确切功能尚不清楚。为了克服这一障碍，我们生成了一种内源标记的 SPG11 人诱导多能干细胞 (hiPSC) 系 (SPG11-HA)。标记是通过使用 CRISPR/Cas9 技术将具有同源定向修复的 HA 标签插入市售人类游离型 iPSC 系 (A18945；Thermo Fisher Scientific) 中进行的。用编码 SpCas9、GFP 和单个向导 RNA (gRNA；addgene) 的载体以及单链寡核苷酸 (ssODN) 供体 DNA 进行核转染。ssODN 包含一个 HA 编码区，两侧是 ~66 – 67 个核苷酸同源臂（图 1 AB）。经过单细胞分选程序和克隆扩增后，通过 PCR 扩增和桑格测序鉴定出阳性候选者（图 1 A）。通过 Sanger 和 Amplicon/NGS 测序确认了基因型 (图 1 A、C)。在预测的脱靶位点未检测到致病变异 (图 S1 A)。与未经过 CRISPR 过程的 iPSC 对照细胞 (ctrl) 相比，染色体微阵列分析未发现核转染报告系中存在任何从头拷贝数变异 (CNV) (图 1 D)。然而，在这两种细胞系中均发现了 20q11.21 处的增益。这种 CNV 在 hiPSC 和癌症中反复出现，表明它具有增殖或生存优势 (Nguyen et al., 2014)。ctrl 和 SPG11-HA iPSC 均表现出典型的多能性细胞样形态，并经支原体检测呈阴性 (图 S1 BC)。两种细胞系均表达多能性标记，并在三系分化范式测试中分化为所有三个胚层的衍生物（图 1 EF；图 S1 D；表 1）。为了验证报告细胞系的功能，通过蛋白质印迹研究了标记的 spatacsin 的表达。正如预期的那样，HA 标记的 spatacsin 在 280 kDa 的大小下可检测到（图 1 G）。由于 spatacsin 功能丧失后表现出一系列神经系统症状，因此评估了神经分化能力。近 90% 的分化对照和 SPG11-HA 神经祖细胞 (NPC) 表达
系统分析CRISPR/Cas9技术中提高同源直接修复（HDR）效率的因素
事实证明，CRISPR/Cas9 细菌系统是多种生物体中基因操作的有力工具，但同源直接修复 (HDR) 序列替换的效率远低于随机插入/缺失创建。许多研究集中于使用双 sgRNA、细胞同步化循环和合理设计的单链寡 DNA 核苷酸 (ssODN) 递送来提高 HDR 效率。在本研究中，我们评估了这三种方法在提高 HDR 效率方面的协同作用。我们选择了 TNF α 基因 (NM_000594) 进行测试，因为它在各种生物过程和疾病中起着至关重要的作用。我们的结果首次展示了使用两个具有不对称供体设计和三重转染事件如何显著提高 HDR 效率，从不可检测的 HDR 事件提高到 39% 的 HDR 效率，并提供了一种促进 CRISPR/Cas9 介导的人类基因组编辑的新策略。此外，我们证明了可以使用 CRISPR/Cas9 方法编辑 TNF α 基因座，这是一个在未来安全地纠正每位患者的特定突变的机会。
CRISPR CAS9和CAS12A同源指导维修的优化设计参数
CRISPR – CAS蛋白是用于在靶向基因组基因座上引入双链断裂（DSB）的RNA引导的核酸酶。DSB通过内源性细胞途径（例如非同源末端连接（NHEJ）和同源指导修复（HDR））修复。在修复过程中提供外源DNA模板，可以通过HDR途径有意，精确地掺入所需的突变。但是，与更快但准确的NHEJ介导的修复相比，HDR的维修率通常很慢。在这里，我们使用单链寡脱氧核苷酸（SSODN）供体模板描述了全面的设计注意事项和优化的高效HDR方法，用于包括S.P.Cas9，S.P。 cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。 针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。 这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。 工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdrCas9，S.P。cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdr
连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。
CRISPR 共编辑策略实现无疤痕同源性......
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 通过提供一种简单而强大的方法来切割特定的基因组序列，彻底改变了基因组编辑。然而，在目标位点引入模板化变化通常需要同源定向修复 (HDR)，而这种修复仅在培养的一小部分细胞中起作用。为了富集 HDR 依赖性编辑细胞，我们采用了一种共同编辑策略，即在挽救内源性预制温度敏感 (ts) 突变的同时编辑目标基因 (GOI)。通过使用 ts 突变的修复作为可选择标记，由于编辑会恢复野生型 (wt) 序列，因此选择是“无疤痕的”。为了验证原理，我们使用了 HEK293 和 HeLa 细胞，这些细胞在必需的 TAF1 基因中发生了 ts 突变。 CRISPR 联合编辑 TAF1ts 和 GOI 可使高达 90% 的耐高温细胞携带 GOI 中的所需突变。我们使用该系统插入由质粒供体编码的大盒和由单链寡核苷酸供体 (ssODN) 编码的较小变化。值得注意的是，我们编辑的基因之一是在蛋白酶体亚基 PSMB6 中引入 T35A 突变，从而消除其 caspase 样活性。编辑后的细胞显示出这种活性的特定降低，证明了该系统在生成具有内源基因生物学相关突变的细胞系中的实用性。这种方法提供了一种快速、高效且无疤痕的方法来选择需要 HDR 的基因组编辑细胞。