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TRUECUT™CAS9蛋白
Invitrogen™TRUECUT™Cas9蛋白用于使用CRISPR技术的基因组编辑应用。cas9蛋白与CRISPR-CAS9系统的引导RNA（GRNA）成分形成非常稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物。纳入核定位信号（NLS）的掺入有助于其向细胞核的传递，从而增加了基因组DNA裂解的速率。与质粒系统相比，它可以迅速清除，从而最大程度地减少了脱靶裂解的机会（Liang等，2015）。与基于质粒的CRISPR系统相比，CAS9核酸酶已在多种悬浮液和粘附细胞系中进行了测试，并且显示出优异的基因组裂解效率和细胞的生存能力。
Lentipool V2人CRISPR库 - 用户指南实现特定于目标效率-truecut-hifi-cas9-
为了更好地了解Truecut Hifi Cas9的高保真度，我们评估了HEK293基因组中的其他基因。使用TEG-Seq进行了更多全基因组筛查，以检测HEK1，HEK4，VEG1和VEG3基因中的靶标。数据表明，Truecut Hifi Cas9比WT-CAS9和供应商I高保真CAS9蛋白产生的脱离目标较少（图1）。将每个编辑位点的脱靶编辑百分比与靶向编辑的百分比进行了比较，以确定相应站点的脱靶/靶向概率比。每个编辑事件均与其概率比（图1A）绘制，并根据概率将OFF目标的总数分组（图1B）。结果表明，与WT-CAS9和供应商I高保真CAS9相比，Truecut Hifi Cas9产生的脱靶编辑明显少得多。truecut hifi cas9只有一个非目标编辑的概率> 10％。相比之下，WT-CAS9和供应商I高保真CAS9分别具有16和6折叠目标（图1B）。
细胞治疗应用的基因修饰
细胞 从 3 名健康人类供体的新鲜白细胞分离物中分离出的 PBMC 电穿孔期间的细胞浓度 5 x 10 7 个细胞/mL 有效载荷 CTS TrueCut Cas9 蛋白 120 µg/mL 定制 TRAC sgRNA 30 µg/mL 线性 CAR 供体 dsDNA 240 µg/mL 电穿孔方案 氖系统电穿孔方案 #24 1,600 V；10 毫秒；3 个脉冲 CTS 氙气系统电穿孔方案 2,300 V；3 毫秒；4 个脉冲
完整的单元工程解决方案
图1。用Truecut Cas9蛋白V2和相应的TrueGuide SGRNA对多个基因靶标的基因组编辑进行。使用优化的转染方案和脂肪切开胺CRISPRMAX转染试剂在两种细胞系中实现：A549，人类肺癌细胞系；和人类乳腺癌细胞系MDA-MB231。这些图还比较了使用其他供应商的产品和推荐协议比较相同的实验。使用Invitrogen产品，与其他供应商的产品和协议相比，低效基因座（PRKCG和CMPK1）的裂解效率得到提高，并显示出较高的效率，最高两倍。
应用说明 | CTS HiFi Cas9 蛋白
图 1. CTS HiFi Cas9 蛋白 (CTS HF Cas9) 显著降低了原代 T 细胞中脱靶效应的发生率。将三种 Cas9 蛋白与三种 Invitrogen ™ TrueGuide ™ 合成 sgRNA 混合，形成九种复合物（RNP：50 pmol sgRNA、38 pmol Cas9、50 pmol dsTag，用于 Invitrogen ™ Neon ™ 转染系统中的 1.5 x 10⁶ T 细胞（100 µL）*）。使用 Neon 转染系统将每个 RNP 复合物递送到原代 T 细胞中。从 NGS TEG-seq 检测（点图）中获得每个 gRNA 的在靶和脱靶效应读数。每个脱靶/在靶比（蓝点）是根据单个脱靶的每百万读数 (RPM) 除以相应在靶的 RPM 计算得出的。红点代表相应的在靶，并标准化为 100%。 x 轴是任意的。CTS WT Cas9 是 CTS TrueCut Cas9 蛋白。
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为了访问这些优化的基因组编辑方法，我们创建了Invitrogen™Truedesign™基因组编辑器，这是一种免费的在线工具，用于设计和订购基于CRISPR-Cas9的编辑。本申请说明描述了两种用例：（1）引入诱导多能干细胞（IPSC）（IPSC）和（2）用GFP标记β-肌动蛋白的LRRK2基因（G2019S）中的SNP变化。对于SNP变化，通过在线工具自动生成了单链寡核苷核苷酸（SSODN）供体的建议设计。对于融合蛋白，使用Invitrogen™TRUETAG™供体DNA试剂盒自动生成底漆建议，以自动生成双链供体DNA。供体DNA。此应用程序说明还描述了此转染过程的详细协议。一旦输送到细胞中，供体DNA将在不到一天的时间内将其集成到目标细胞的基因组中。