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dyrk1a是Xenopus laevis
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2024年1月14日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.01.13.575394 doi：Biorxiv Preprint
社论：非洲爪蟾器官发生和疾病模型
长期以来，我们一直通过动物模型进行推断，以更好地了解我们自己的生物学和健康状况。 在这些模型中，两栖动物，尤其是非洲爪蟾，已成为生物学发现的强大源泉，为胚胎学、细胞生物学、遗传学、生理学、毒理学、进化、生态学和疾病的基本过程提供了惊人的见解。 事实上，对两栖动物的研究一直在开辟新的发现领域，这一事实反映在众多诺贝尔生理学或医学奖的贡献中，从因发现毛细血管运动调节机制而获得的奥古斯特奖（Lindstedt，2014）开始，最近的是 John Gurdon 于 2012 年因将成熟细胞重编程为多能性而获得的奖项（Krogh，1919；Gurdon 等人，1958；Gurdon 和 Hopwood，2000；Burggren 和 Warburton，2007；Blum 和 Ott，2018）。在过去的 70 年里，非洲爪蟾已经成为主要的两栖动物模型和全球使用最广泛的模型系统之一，对生物学研究产生了巨大的影响。非洲爪蟾原产于南非和中非，最初在 20 世纪 30 年代和 40 年代传入欧洲和北美的实验室，成为当时领先的妊娠试验；注射一次含有促性腺激素的人尿足以在数小时内诱发产卵（ Gurdon 和 Hopwood，2000 年）。然而，这种通过简单的激素注射就能全年按需产生数千个卵子和体外发育胚胎的能力，使得非洲爪蟾比其他可用的实验模型具有明显的优势。再加上它的卵母细胞和胚胎很大，非常适合生化、细胞生物学和胚胎学操作，易于进行基因组操作，与人类进化相对接近，维护成本低，生命周期短，这些都使非洲爪蟾成为一种非常有价值的模型。在过去的二十年中，二倍体物种 X.tropicalis 的建立作为实验室模型增加了额外的强大遗传工具（Grainger，2012；Tandon 等人，2017）。X.laevis 和 X.tropicalis 共同使我们能够快速研究体内和体外的基本生物学过程。这使得 Xenopus 成为基因组时代的理想系统，我们需要适合测试人类疾病基因功能的有效模型。本研究主题的目的是强调 Xenopus 作为研究人类发育、疾病和病理的模型系统的出色多功能性和实用性。它包括 18 篇主要研究和评论文章，探讨了各种主题，包括发育、再生、癌症、生物缩放和人类疾病建模，并概述了可用于支持 Xenopus 研究的广泛资源。我们希望它将成为既有经验的 Xenopus 研究人员的资源，以及寻找适合其研究的模型系统和方法的 Xenopus 新手。
CRISPR/Cas9 介导的视网膜色素变性模型揭示了非洲爪蟾和热带爪蟾穆勒细胞的差异性增殖反应
摘要：视网膜色素变性是一种遗传性视网膜营养不良症，由于视杆细胞逐渐退化，视锥细胞随后非细胞自主性死亡，最终导致失明。视紫红质是本病中最常见的突变基因。本文利用 CRISPR/Cas9 技术，在两种非洲爪蟾（非洲爪蟾和热带爪蟾）中开发了基于视紫红质基因编辑的视网膜色素变性模型。在这两种蟾蜍中，视紫红质功能的丧失都会导致大量视杆细胞变性，其特征是外节逐渐缩短，偶尔会出现细胞死亡，随后视锥细胞形态恶化。尽管这些退化环境看似相似，但我们发现 Müller 神经胶质细胞在非洲爪蟾和热带爪蟾中的行为不同。虽然非洲爪蟾中相当一部分穆勒细胞重新进入细胞周期，但它们在热带爪蟾中的增殖仍然极其有限。因此，这项研究揭示了近亲物种对视网膜损伤的不同反应。这些模型应该有助于我们在未来加深对进化过程中塑造再生的机制的理解，而脊椎动物之间存在巨大差异。
精子衍生的 H2AK119ub1 是非洲爪蟾胚胎发育所必需的
23 多梳抑制复合物-1 沉积的 H2AK119ub1 在体细胞中启动兼性异染色质形成过程中起着关键作用。我们在此评估精子衍生的 H2AK119ub1 对胚胎发育的贡献。我们发现，在非洲爪蟾中，H2AK119ub1 在精子发生过程中以及胚胎发育早期都存在，这突出表明了其在精子向胚胎传递表观遗传信息方面发挥的作用。在注射到卵子之前，用 H2AK119ub1 去泛素化酶 USP21 对精子进行体外处理会导致与基因上调相关的发育缺陷。精子 H2AK119ub1 编辑会破坏卵子因子介导的父系染色质重塑过程。它导致复制后 H2AK119ub1 在基因组重复元件上积累，而不是在 CpG 岛上。精子表观基因组编辑引发的复制后 H2AK119ub1 分布的这种变化导致 USP21 处理精子产生的胚胎中 H2AK119ub1 基因失调。我们得出结论，精子来源的 H2AK119ub1 指导卵子因子介导的父系染色质表观遗传重塑，是胚胎发育所必需的。
实时监测爪蟾鸡蛋提取物中单个DNA分子的压实
DNA压实是在有丝分裂过程中凝结和分辨率的凝结和分辨率所必需的，但是单个染色质因子对该过程的相对贡献知之甚少。我们使用高速爪蟾卵提取物和光学镊子开发了一种生理，无细胞的系统，以研究实时有丝分裂染色质纤维的形成，并在单个DNA分子上进行力诱导的拆卸。与将DNA压缩约60％的相间提取物相比，中期提取物将DNA的长度降低了90％以上，这反映了这两种情况下全染色体形态的差异。抑制核小体组装的核心组蛋白伴侣ASF1的耗竭，将中期纤维压实的最终程度降低了29％，而接头组蛋白H1的耗竭效果更大，将总压实降低了40％。 与对照组相比，两种耗竭都降低了压实率，导致了更短的分解时间，并提高了力诱导的纤维拆卸速度。 相比之下，中期提取物中冷凝蛋白的耗竭强烈抑制纤维组件，从而导致瞬态压实事件在高力下迅速逆转。 总的来说，这些发现支持了一种投机模型，在该模型中，冷凝蛋白在有丝分裂DNA压实中起主要作用，而核心和接头组蛋白起作用，可在循环挤出过程中减少滑移并调节DNA压实程度。抑制核小体组装的核心组蛋白伴侣ASF1的耗竭，将中期纤维压实的最终程度降低了29％，而接头组蛋白H1的耗竭效果更大，将总压实降低了40％。与对照组相比，两种耗竭都降低了压实率，导致了更短的分解时间，并提高了力诱导的纤维拆卸速度。相比之下，中期提取物中冷凝蛋白的耗竭强烈抑制纤维组件，从而导致瞬态压实事件在高力下迅速逆转。总的来说，这些发现支持了一种投机模型，在该模型中，冷凝蛋白在有丝分裂DNA压实中起主要作用，而核心和接头组蛋白起作用，可在循环挤出过程中减少滑移并调节DNA压实程度。
组织靶向 CRISPR-Cas9 介导的 F0 代 Xenopus laevis 胚胎中多个同源物的基因组编辑
Xenopus laevis 青蛙是一种强大的发育模型，可用于将经典胚胎学与分子操作相结合的研究。由于胚胎尺寸大、易于显微注射以及能够通过已建立的命运图谱靶向组织，X. laevis 已成为主要的两栖动物研究模型。鉴于它们的异源四倍体基因组使基因敲除的产生变得复杂，需要制定策略来有效地诱变多个同源基因以评估基因功能。在这里，我们描述了一种利用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑来靶向 F 0 X. laevis 胚胎中的单个等位基因或多个等位基因的方案。单个向导 (sg) RNA 旨在靶向编码关键蛋白质结构域的特定 DNA 序列。为了诱变具有两个等位基因的基因，sgRNA 是针对两个同源基因共有的序列设计的。该 sgRNA 与 Cas9 蛋白一起被微注射到受精卵中，以破坏整个胚胎中的基因组序列或进入特定的胚泡，以产生组织靶向效应。CRISPR/Cas9 产生的 DNA 双链断裂的易错修复会导致插入和缺失，从而在胚胎内产生嵌合基因病变。对从每个嵌合 F 0 胚胎中分离的基因组 DNA 进行测序，并使用软件评估产生的突变的性质和嵌合程度。该方案能够敲除整个胚胎或 F 0 X. laevis 胚胎中特定组织中的基因，以便于评估产生的表型。
实时监测爪蟾鸡蛋提取物中单个DNA分子的压实
DNA压实是在有丝分裂过程中凝结和分辨率的凝结和分辨率所必需的，但是单个染色质因子对该过程的相对贡献知之甚少。我们使用高速爪蟾卵提取物和光学镊子开发了一种生理，无细胞的系统，以研究实时有丝分裂染色质纤维的形成，并在单个DNA分子上进行力诱导的拆卸。与将DNA压缩约60％的相间提取物相比，中期提取物将DNA的长度降低了90％以上，这反映了这两种情况下全染色体形态的差异。抑制核小体组装的核心组蛋白伴侣ASF1的耗竭，将中期纤维压实的最终程度降低了29％，而接头组蛋白H1的耗竭效果更大，将总压实降低了40％。 与对照组相比，两种耗竭都降低了压实率，导致了更短的分解时间，并提高了力诱导的纤维拆卸速度。 相比之下，中期提取物中冷凝蛋白的耗竭强烈抑制纤维组件，从而导致瞬态压实事件在高力下迅速逆转。 总的来说，这些发现支持了一种投机模型，在该模型中，冷凝蛋白在有丝分裂DNA压实中起主要作用，而核心和接头组蛋白起作用，可在循环挤出过程中减少滑移并调节DNA压实程度。抑制核小体组装的核心组蛋白伴侣ASF1的耗竭，将中期纤维压实的最终程度降低了29％，而接头组蛋白H1的耗竭效果更大，将总压实降低了40％。与对照组相比，两种耗竭都降低了压实率，导致了更短的分解时间，并提高了力诱导的纤维拆卸速度。相比之下，中期提取物中冷凝蛋白的耗竭强烈抑制纤维组件，从而导致瞬态压实事件在高力下迅速逆转。总的来说，这些发现支持了一种投机模型，在该模型中，冷凝蛋白在有丝分裂DNA压实中起主要作用，而核心和接头组蛋白起作用，可在循环挤出过程中减少滑移并调节DNA压实程度。
利用两栖动物非洲爪蟾开展基础和医学免疫学研究的实验平台
两栖动物非洲爪蟾是一种功能强大、用途广泛且经济高效的非哺乳动物模型，可用于研究与人类健康相关的当代重要免疫问题，例如免疫的个体发育、自我耐受、伤口愈合、自身免疫、癌症免疫、免疫毒理学以及宿主免疫防御对新出现的病原体的适应。该模型系统具有几个吸引人的特征：外部发育环境不受母体影响，可从生命早期阶段轻松进行实验；免疫系统与哺乳动物的免疫系统非常相似；可获得大规模遗传和基因组资源；无价的主要组织相容性复合体 (MHC) 定义的青蛙近交系；以及有用的工具，例如淋巴肿瘤细胞系、单克隆抗体和 MHC 四聚体。应用于免疫功能的现代反向遗传功能丧失和基因组编辑技术进一步增强了该模型。最后，非洲爪蟾与哺乳动物之间的进化距离使我们能够区分物种特异性适应与免疫系统更保守的特征。在本介绍中，概述了非洲爪蟾在免疫学研究中的优势和特点，以及使用该模型系统的现有工具、资源和方法。
DNA 甲基化动力学是非洲爪蟾蝌蚪脑中变态基因调控程序的基础
DNA 中胞嘧啶残基的甲基化会影响染色质结构和基因转录，其调控对大脑发育至关重要。越来越多的证据表明，DNA 甲基化可受激素信号调节。我们分析了变态过程中 Xenopus 蝌蚪大脑中 DNA 甲基化的全基因组变化及其与基因调控的关系，变态是一个依赖甲状腺激素的发育过程。我们研究了蝌蚪大脑中含有控制垂体激素分泌的神经分泌神经元的区域，该区域对甲状腺激素作用高度敏感。使用甲基化 DNA 捕获测序 (MethylCap-seq)，我们发现了整个蝌蚪神经细胞基因组中 DNA 甲基化的多样化景观，成对阶段比较确定了数千个差异甲基化区域 (DMR)。在变态前期至变态前期，DMR 的数量最低 (1,163)，去甲基化占主导地位。从变态前期到变态高潮期，DMR 几乎翻了一番（2,204），甲基化占主导地位。DNA 甲基化的最大变化出现在变态高潮期到变态完成期（2960 个 DMR），其中 80% 的 DMR 代表去甲基化。使用 RNA 测序，我们发现差异表达基因与位于基因体和转录起始位点上游区域的 DMR 之间存在负相关性。MethylCap-seq 揭示的变态期 DNA 去甲基化通过 DNA 去甲基化中间体 5-羟甲基胞嘧啶和 5-羧甲基胞嘧啶以及催化 DNA 去甲基化的甲基胞嘧啶双加氧酶十十一易位 3 的免疫反应性增加得到证实。我们的研究结果表明，蝌蚪神经细胞的基因组在变态过程中会发生显著的 DNA 甲基化变化，这些变化可能会影响染色质结构和此发育时期发生的基因调控程序。
除草剂利谷隆对热带爪蟾大脑和睾丸 DNA 甲基化谱的雄性传递跨代效应
除草剂利谷隆可对非洲爪蟾（Xenopus Tropicalis）产生内分泌干扰作用，包括从未接触过该污染物的后代。这些影响跨代传递的机制有待进一步研究。在这里，我们研究了大脑和睾丸 DNA 甲基化谱的跨代改变，这些改变是从发育过程中接触到环境相关浓度利谷隆的祖父那里遗传下来的。简化代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 揭示了成年雄性 F2 代大脑 (3060 个 DMR) 和睾丸 (2551 个 DMR) 中的许多差异甲基化区域 (DMR)。大脑中参与生长激素 ( igfbp4 ) 和促甲状腺激素信号传导 ( dio1 和 tg ) 的关键基因存在差异甲基化，并与体型、体重、后肢长度和血糖水平的表型改变相关，表明这些甲基化变化可能是利谷隆跨代效应的潜在介质。睾丸 DMR 存在于精子发生、减数分裂和生殖细胞发育所必需的基因（ piwil1 、 spo11 和 tdrd9 ）中，其甲基化水平与每个曲细精管的生殖细胞巢数量相关，这是精子发生中断的终点。DMR 还存在于调节表观遗传景观的机制（包括 DNA 甲基化）的几个基因中