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用于多重 dropout 筛选的基准化、高效 prime 编辑平台 4
(E) 来自 StopPR 筛选的基因水平生长表型（计算为第 14 天每个基因绝对最强的两个 stop 287 epegRNA 的平均表型）由 CRISPRi 表型（如先前在 K562 细胞中确定）分组。54 个体 p 值分别为 288 1.13E-3（重度 vs. 中度）、4.00E-12（中度 vs. 轻度）和 < 2.62E-14（重度 vs. 轻度）来自 ANOVA 和 Tukey 事后分析（** 289 p < 0.01，*** p < 0.001）。标出了本分析中使用的全套 epegRNA 的中位数和四分位距 (IQR)。须线 290 延伸 1.5*IQR 超过上四分位数和下四分位数。虚线表示表型截止（Z < -2）。291
开发高效的 prime editor 系统...
编辑效率不足在很大程度上限制了引物编辑系统在构建基因组编辑动物中的应用。本研究验证了 pegRNA 和 epegRNA 的 PBS Tm 对编辑效率的影响。发现最佳 Tm 为 42°C，且受培养温度的影响。然后，我们在 N2a 细胞中测试了各种提高引物编辑效率的策略，ePE3max 和 ePE5max 表现出显著提高编辑效率。然而，只有 ePE3max 在小鼠和兔胚胎中表现出相当高的编辑效率。我们的结果表明
高效修饰和制备环状 DNA 以在细胞培养中表达
DNA 质粒是细胞培养实验中 RNA 和蛋白质传递和表达的重要工具之一。质粒的制备通常涉及繁琐的细菌克隆、验证和纯化过程。虽然可以从合同制造商处设计和订购表达质粒，但当需要大量质粒时，成本可能会过高。我们开发了一种高效的全合成方法和协议，能够在短短 3 小时内生产出包含表达元件的环化 DNA，这些元件可供转染，从而省去了细菌克隆步骤。该协议描述了如何将使用常用软件设计并从其中一个商业制造商处订购的线性双链 DNA 片段作为输入，然后以最少的动手时间有效地环化和纯化该 DNA 片段。作为该原理的证明，我们通过生产表达扩展的 Prime 编辑向导 RNA (epegRNA) 的 DNA 来展示该方法的功能，用于细胞培养基因组编辑。该方法不仅限于基因编辑，还可用于需要表达短 RNA 和蛋白质的各种应用。速度快、成本低、使用方便，将使该方法成为基因编辑工具包中的另一个有价值的工具，而且由于反应简单，该方案可以轻松实现自动化。
工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）用于...
使用CRISPR / CAS实施治疗性体内基因编辑，依赖于基因编辑工具的有效输送。由CAS蛋白和单个指南RNA（SGRNA）组成的核糖核蛋白（RNP）复合物提供了短期的编辑活性和安全优势，而不是惯性病毒和非病毒基因和RNA Delivery方法。通过工程慢病毒衍生的纳米颗粒（LVNP）促进RNP的递送，我们证明了SPCAS9以及SPCAS9衍生的基础和Prime Editor（BE / PE）的有效施用，从而导致受体细胞中的基因编辑。独特的GA G / GA GPOL蛋白融合策略促进了LVNP中的RNP包装，并确定LVNP stoichiometry y支持优化的LVNP收益率和治疗有效负载的纳入。我们将在4天内进行瞬时目标DNA C LEAV年龄，并在4天内完成RNP周转。结果，与培养细胞中标准的d rnp nuc Leofection相比，LVNP降低了靶向dna c leav年龄和tale of tar clea族的活性。lvnps可容纳be / sgrna和pe / epegrna rnps，导致基础编辑，旁观者编辑和质量编辑降低而无需检测到的indel indel形成。值得注意的是，在鼠标眼中，我们介绍了LVNP指导的体内基因破坏的第一个概念概念。我们的发现建立LVNP作为促进的车辆或促进RNP的交付
介导 DMD 基因外显子跳跃的主要编辑策略
杜氏肌营养不良症是一种罕见且致命的遗传性疾病，因 DMD 基因突变导致进行性肌肉萎缩。我们使用 CRISPR-Cas9 Prime 编辑技术开发了不同的策略来纠正 DMD 基因中外显子 52 或外显子 45 至 52 缺失的移码突变。使用优化的 epegRNA，我们能够在高达 32% 的 HEK293T 细胞和 28% 的患者成肌细胞中诱导外显子 53 剪接供体位点的 GT 核苷酸的特异性替换。我们还分别在 HEK293T 细胞和人类成肌细胞中实现了外显子 53 的 GT 剪接位点的 G 核苷酸的缺失高达 44% 和 29%，以及在外显子 51 的 GT 剪接供体位点之间插入 17% 和 5.5% 的 GGG。修改外显子 51 和外显子 53 的剪接供体位点可引发它们的跳跃，从而分别允许外显子 50 连接到外显子 53 和外显子 44 连接到外显子 54。如蛋白质印迹所示，这些修正恢复了肌营养不良蛋白的表达。因此，使用 Prime 编辑在外显子 51 和 53 的剪接供体位点诱导特定的替换、插入和缺失，以分别纠正 DMD 基因中携带外显子 52 和外显子 45 至 52 缺失的移码突变。
利用内源性小 RNA 改进主要编辑...
通过逆转录附加在 CRISPR–Cas 向导 RNA 3′ 端的模板序列，可以实现对基因组的精确修改 1 。为了确定细胞中引导编辑的因素，我们开发了可扩展的引导编辑报告基因并进行了基因组规模的 CRISPR 干扰筛选。从这些筛选中，我们发现一个单一因子成为引导编辑的最强介质：小 RNA 结合核酸外切酶保护因子 La。进一步研究表明，La 可在各种方法（PE2、PE3、PE4 和 PE5）、编辑类型（替换、插入和删除）、内源性基因座和细胞类型中促进引导编辑，但对依赖标准、未延伸向导 RNA 的基因组编辑方法没有一致的效果。先前的研究表明，La 与 RNA 聚合酶 III 转录本 2 的 3′ 端的多尿苷束结合。我们发现 La 在功能上与多尿苷化的引导 RNA（pegRNA）的 3′ 端相互作用。在这些结果的指导下，我们开发了一种与 La 的 RNA 结合 N 端结构域融合的 Prime Editor 蛋白 (PE7)。该编辑器通过表达的 pegRNA 和工程化的 pegRNA (epegRNA) 以及针对 La 结合优化的合成 pegRNA 改进了 Prime Editor。总之，我们的结果提供了关于 Prime Editor 组件如何与细胞环境相互作用的关键见解，并提出了在其中稳定外源小 RNA 的一般策略。
基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editor 在疾病建模和再生医学方面具有巨大潜力，包括针对肌肉萎缩症杜氏肌营养不良症 (DMD) 的研究。然而，Prime 编辑系统的庞大规模和多组分性质带来了巨大的生产和交付问题。本文，我们报告将优化的全长 Prime 编辑构建体包装在腺病毒载体颗粒 (AdVP) 中，可以在人类成肌细胞（即成肌细胞和间充质干细胞）中安装精确的 DMD 编辑（分别高达 80% 和 64%）。AdVP 转导确定了优化的 Prime 编辑试剂，这些试剂能够恢复约 14% 患者基因型的 DMD 阅读框架，并恢复未选择的 DMD 肌细胞群中的肌营养不良蛋白合成和肌营养不良蛋白-β-肌营养不良聚糖连接。 AdVP 同样适用于纠正 DMD iPSC 衍生的心肌细胞，并通过靶向外显子 51 缺失提供针对 DMD 修复的双引物编辑器。此外，通过利用不依赖细胞周期的 AdVP 转导过程，我们报告 2 组分和 3 组分引物编辑模式在细胞周期中最活跃，而不是在有丝分裂后细胞中。最后，我们确定将 AdVP 转导与无缝引物编辑相结合可以通过连续的递送轮次堆叠染色体编辑。总之，AdVP 允许对高级引物编辑系统进行多种研究，而不管其大小和组分数量如何，这应该有助于它们的筛选和应用。引言由序列定制的向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 内切酶组成的可编程核酸酶是基因组编辑的有力工具。然而，双链 DNA 断裂 (DSB) 的普遍修复是通过容易出错的末端连接过程进行的，这赋予了基于核酸酶的基因组编辑内在的高诱变特性。相比之下，prime 编辑允许在特定基因组序列上安装任何单个碱基对变化和精确的小插入或删除 (indel)，而不会形成 DSB (1)。通常，prime 编辑复合物包含与切口 Cas9 变体 (prime editor) 融合的工程逆转录酶 (RT) 和 3' 端延伸的 gRNA，称为 prime 编辑向导 RNA (pegRNA)。pegRNA 分别通过其间隔物和 RT 模板部分指示靶位点选择和感兴趣的编辑。在靶位点切口后，释放的单链 DNA 与 pegRNA 的引物结合位点 (PBS) 退火，引发 RT 介导的 RNA 模板复制为互补 DNA，在基因组位点杂交、瓣切除和 DNA 修复或复制后，导致靶向染色体编辑 (1)。prime 编辑有两种主要模式，即 PE2 和 PE3 (1)。前者的 2 组分系统仅依赖于一个引物编辑蛋白（例如 PE2）和一个 pegRNA，而后者的 3 组分系统则需要一个补充的常规 gRNA。在 PE3 中，gRNA 引导的未编辑 DNA 链切口促使其被编辑链取代，这通常会导致同源双链 DNA 编辑频率更高，尽管同时增加了插入/缺失副产物 (1)。最近，基于将 prime editor 与双 pegRNA 一起递送的多重 prime 编辑正在进一步扩大 DSB 独立的基因组编辑程序的范围。事实上，在这种情况下，一对 prime 编辑复合物协同作用以安装基因组插入、删除和/或替换，其大小远远大于通过 PE2 和 PE3 策略实现的插入、删除和/或替换 (2-7)。由于其巨大的潜力和多功能性，prime 编辑系统正在快速发展，包括改进的 prime 编辑蛋白和 pegRNA，例如 PEmax (8) 和工程 pegRNA (epegRNA) 架构 (9,10)。PEmax 构建体在其 Cas9 切口酶和 RT 部分分别整合了特定突变和密码子优化，有助于增强 prime 编辑活性 (8)。 epegRNA 具有以结构化 RNA 假结形式延伸的 3' 端（例如 tevopreQ1），可保护它们免受核酸外切降解（9,10）。尽管取得了这些重要进展，但 Prime 编辑组件的庞大尺寸造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了它们最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 Prime 编辑器构建体拆分为亚基，这些亚基在进入细胞后原位组装束缚或未束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分（11-20）。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 Prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。