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分裂标记介导的基因组编辑提高了 CTG 分支酵母中间假丝酵母中的同源重组频率
基因组编辑工具箱对于探索和利用非常规酵母物种作为细胞工厂至关重要，因为它们促进了基因组研究和代谢工程。非常规酵母中间假丝酵母 (Candida intermedia) 是一种在生物技术上很有趣的物种，因为它能够将多种碳源（包括林业和奶制品行业废弃物和侧流中的木糖和乳糖）转化为增值产品。然而，由于缺乏针对该物种的分子工具，迄今为止，进行基因操作的可能性有限。我们在此描述了一种针对中间假丝酵母 (C. intermedia) 的基因组编辑方法的开发，该方法基于电穿孔和基因删除盒，其中包含白色假丝酵母 NAT1 显性选择标记，两侧是与目标基因座同源的 1000 个碱基对序列。针对 ADE2 基因的线性删除盒最初导致的靶向效率 < 1%，这表明中间假丝酵母 (C. intermedia) 主要使用非同源末端连接来整合外来 DNA 片段。通过开发一种基于分裂标记的 C. intermedia 缺失技术，我们成功提高了同源重组率，实现了高达 70% 的靶向效率。对于无标记缺失，我们还将分裂标记盒与重组酶系统结合使用，从而能够通过标记回收构建双缺失突变体。总体而言，分裂标记技术被证明是一种快速可靠的 C. intermedia 基因缺失方法，这为揭示和增强其细胞工厂潜力提供了可能性。
通过 CRISPR/Cas 介导的同源重组在模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 中进行有效的基因替换
CRISPR/Cas 能够对包括模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 在内的许多不同植物和藻类进行靶向基因组编辑。然而，迄今为止，仅报道了通过同源重组 (HR) 实现的有效基因靶向适用于单倍体生命周期阶段的光合生物。在这里，使用 Golden Gate 克隆组装的 CRISPR/Cas 构建体能够在二倍体光合生物中实现高效的 HR。使用序列特异性 CRISPR/Cas 并与 dsDNA 供体基质配对，在 T. pseudonana 中诱导同源重组，从而用抗性盒 (FCP: NAT) 替换 silacidin、硝酸还原酶和脲酶基因。通过嵌套 PCR 筛选出高达约 85% 的 NAT 抗性 T. pseudonana 菌落对 HR 呈阳性。使用反向 PCR 方法确认了 FCP: NAT 在每个位点的精确整合。硝酸还原酶和尿素酶基因的敲除分别影响了硝酸盐和尿素的生长，而 T. pseudonana 中 silacidin 基因的敲除导致细胞尺寸显著增加，证实了该基因在中心硅藻中调节细胞尺寸的作用。HR 的高效基因靶向使 T. pseudonana 像 Nannochloropsis 和 Physcomitrella 一样易于遗传处理，从而迅速推进了功能性硅藻生物学、生物纳米技术和生物技术应用，这些应用旨在利用硅藻的代谢潜力。
引用：Tang L，Zhang Y，Wang F等。同源灭活疫苗BOO
目标两次Covid-19爆发发生在2022年初在河南省发生，其中一个是三角洲的爆发，另一个是Omicron变体爆发。疫苗在爆发时使用的疫苗被灭活，为91.8％；蛋白质亚基，7.5％；和腺病毒5向量，0.7％的疫苗。暴发提供了一个机会，可以评估同源灭活的Covid-19疫苗促进剂剂量的特异性突破性感染率和相对的保护效果，以抗症状感染和肺炎。设计回顾性队列研究方法我们使用时间依赖性的COX回归模型对感染个体的密切接触进行回顾性队列研究，评估了相对疫苗有效性（RVE）。人口统计学和流行病学数据是从当地疾病控制和预防中心获得的；临床和实验室数据是从Covid-19指定医院获得的。疫苗接种历史是从国家Covid-19-19疫苗接种数据集获得的。所有数据均通过国家识别号链接。在784个SARS-COV-2感染中的结果，379（48.3％）是由三角洲引起的，405（51.7％）是由Omicron引起的，突破性率分别为9.9％和17.8％。增强个体的突破率为8.1％和4.9％。结论中国共同疫苗接种在中国疫苗接种提供了良好的保护，以防止有症状的Covid-19和Covid-19-19，由三角洲和Omicron变体引起的肺炎。保护后6个月疫苗接种后6个月下降，但通过在初级系列后6个月给定的同源灭活助推器剂量恢复。与感染前接种初次疫苗接种序列≥180天的受试者相比，Cox回归模型表明，同源的促进疫苗接种在统计学上与统计学上显着相关，这与防护剂的保护症具有显着相关性（RVE 59％； RVE 59％; 95％CI 13％至80％至80％）和DELTA引起的7％和OM 62％; 95％CI; 95％ci; 95％; 95％; 95％; 95％; 95％; 95％; 95％； （RVE 87％； 95％CI 3％至98％）。
使用合成的同源供体构建体进行 CRISPR 介导的同源重组，为果蝇基因标记提供扩展工具包
摘要 之前，我们描述了大量果蝇菌株，每个菌株都携带一个人工外显子，其中包含一个基于 CRISPR 介导的同源重组插入目标基因内含子中的 T2AGAL4 盒。这些等位基因可用于多种应用，并且已被证明非常有用。最初，基于同源重组的供体构建体具有较长的同源臂（>500 bps），以促进大型构建体（>5 kb）的精确整合。最近，我们表明，供体构建体的体内线性化使得能够使用短同源臂（100-200 bps）将大型人工外显子插入内含子中。较短的同源臂使得商业合成同源供体成为可能，并最大限度地减少了供体构建体生成的克隆步骤。不幸的是，大约 58% 的果蝇基因缺乏适合所有注释异构体中人工外显子的编码内含子整合。在这里，我们报告了新构建体的开发，这些构建体允许用 KozakGAL4 盒替换缺乏合适内含子的基因的编码区，从而产生与目标基因类似地表达 GAL4 的敲除/敲入等位基因。我们还开发了定制载体骨架，以进一步促进和改善转基因。在包含目标基因 sgRNA 的定制质粒骨架中合成同源供体构建体，无需注射单独的 sgRNA 质粒，并显著提高了转基因效率。这些升级将使几乎所有果蝇基因都能靶向，无论外显子-内含子结构如何，成功率为 70-80%。
将核酸外切酶与 Cas9 融合可增强毕赤酵母中的同源重组
HR 比 NHEJ 慢得多，NHEJ 可以从 DSB 事件中拯救更多细胞。NHEJ 几乎不需要或根本不需要末端切除来直接重新连接 DSB 末端。相比之下，HR 需要短距离切除和长距离切除 DSB 以及供体来实施修复过程。此外，其他蛋白质也可能是 HR 修复途径的限制因素 [18, 19]。我们在此发现，在同时删除两个基因和整合多个片段期间，将 MRE11 与 CAS9 融合可提高 CFU 数量
KSQ-4279：一种用于治疗具有同源重组缺陷癌症的第一类USP1抑制剂
•KSQ-4279是一种可逆的，具有ki = 1.2nm的USP1的变构抑制剂•ksq-4279绑定和未结合的USP1结构均已解决，揭示了诱导的拟合机构
非同源末端连接是 CRISPR/Cas 的关键……
尽管成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 介导的基因编辑已经彻底改变了生物学和植物育种，但大规模的可遗传植物染色体重组仍处于起步阶段。现在可以实现染色体内的重复和倒位，以及染色体之间的易位。随后，可以破坏或新建遗传连锁。此外，染色体上基因的顺序也可以改变。虽然自然染色体重组在减数分裂过程中通过同源重组发生，但 CRISPR/Cas 介导的染色体重排最好通过利用体细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 途径获得。NHEJ 可细分为经典 (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径，它们部分地以拮抗方式运作。 cNHEJ 通路不仅可以保护断裂的 DNA 末端免于降解，还可以抑制先前未连接的断裂末端的连接。因此，在没有 cNHEJ 的情况下，可以获得更多的倒位或易位，这可以归因于无限制地使用 aNHEJ 通路进行双链断裂 (DSB) 修复。与倒位或易位相反，短串联重复可以通过 Cas9 切口酶由成对的单链断裂产生。有趣的是，cNHEJ 通路对于这些类型的重复至关重要，而 aNHEJ 则是补丁插入所必需的，补丁插入也可以在 DSB 修复期间形成。由于染色体工程不仅在模式植物拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中实现，而且在作物玉米 (Zea mays) 中也实现，我们预计这项技术将很快改变育种过程。
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。
方案优化 CRISPR-Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物的电穿孔，用于人类多能干细胞中的无选择同源重组
d. 将培养板放入 37 C 培养箱中并孵育 10 分钟。每 3-4 分钟轻轻摇晃培养板一次有助于完全分离细胞。 e. 加入 1 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，并轻轻吹打细胞直至 iPSC 完全分离。 f. 计数细胞，并将 1.0 3 10 4 –1.5 3 10 4 个细胞接种到 iMatrix 涂层的 6 孔板中，该板含有 2 mL 含有 10 m M Y-27632 的 StemFit 培养基，如步骤 cg 中所述，将细胞在 37 C 的 CO 2 培养箱中孵育过夜。 h. 第二天，用 2 mL StemFit 培养基更换培养基。如果有很多死细胞漂浮，继续向培养基中添加 Y-27632，最终浓度为 10 m M。 i.培养期间每 2 天更换一次培养基。j. iPSC 在第 6-8 天将达到半汇合状态。切勿让它们过度汇合。“半汇合”是指 iPSC 菌落直径小于 2 毫米，并且 iPSC 菌落之间仍有一些间隙。生长速度取决于 iPSC 系，因此应通过实验确定半汇合时间。