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高效 CRISPR/Cas9/AAV 协议
1. 为了在小鼠 HSPC 中实现有效的同源重组 (HR) 事件，需要具有高编辑效率的特定单向导 RNA (sgRNA)。我们使用 CrispRGold 程序 ( https://crisprgold.mdc-berlin.de ) 来设计特定的 sgRNA 并预测潜在的脱靶 ( Chu et al., 2016a )。每个目标序列应设计几个特定的 sgRNA。必须通过使用 T7 内切酶 I 测定 ( Guschin et al., 2010 ) 测量错配的 DNA 异源双链体以及对至少 2 种主要血细胞类型（例如 B 细胞和 T 细胞）的 PCR 产物进行 Sanger 测序来验证所有 sgRNA 的编辑效率。可以从 IDT、Synthego 或其他供应商处订购化学修饰或未修饰形式的 sgRNA。 2. 供体模板的最佳设计对于小鼠 HSPC 中的高效 HR 至关重要。供体模板包括 5'、3' 同源臂和所需的修饰基因序列。同源臂的长度取决于目标序列的特异性，每个同源臂由 600 到 2000 bp 组成。AAV 基因组的包装能力是设计供体模板的一个限制，因为基于 AAV 的供体模板的最大长度不应超过 4.5kb。如果没有使用报告基因，则应通过引入可用于量化 HR 效率的沉默突变将限制性酶识别位点添加到修饰的基因序列中。3. 为了通过 PCR 扩增和测序量化目标位点中的 HR 和非同源末端连接 (NHEJ) 事件，必须在外部设计正向或反向引物，或两者
基因组编辑项目设计的一般准则和实用技巧.docx
方法。第一种方法是将含有 loxP 位点的 ssODN 引入目标外显子两侧的 5' 和 3' 位点。这是通过使用 2 个 sgRNA 完成的。第二种方法使用含有 2 个 loxP 位点的 lssDNA 模板，这 2 个 loxP 位点位于目标 DNA 序列两侧。这种方法使用了 2 个 sgRNA。B. UTSW 转基因核心提供给您的试剂：您向核心支付的 CRISPR 服务费用包括我们用于完成您的项目的 IDT Sp. Cas9 蛋白的费用。如果您的项目涉及使用不同的编辑酶（如 Cas12 或 Cpf），请联系核心工作人员更详细地讨论该项目。C. 了解您的基因的重要细节：使用基因组浏览器（如 NCBI、UCSC 或 ENSEMBl）收集有关您的目标基因的相关信息。这包括任何替代转录本、外显子的数量和重要性、位于特定内含子中的调控基序以及编码序列等细节，以便成功设计 sgRNA 和供体 DNA 模板。使用 MGI- 小鼠基因组信息学来确定是否存在与靶基因敲除相关的已知表型非常重要。了解基因的 KO 是否可能导致致命表型（无论是胚胎还是出生后早期）尤为重要。了解并将此信息传达给核心人员将使我们能够修改用于生成小鼠突变株的条件，以便我们主要创建 KO 等位基因杂合的小鼠。D. sgRNA 的设计：注射受精卵中发生的基因组编辑的效率在很大程度上取决于针对靶标的 sgRNA 的正确设计。此设计的关键组成部分包括：
现已准备好 - 空军预备役司令部
今年，我们向 75 年前创建空军预备役的男女官兵致敬。顺便说一句，今年也是 TASKORD '22 一周年，该计划优先考虑战备和转型。在今年的空军预备役指挥联队指挥官和指挥长会议期间，我有幸在与你们的联队长会面时对这两点进行了反思。在会议讨论中，我提出了两个主题。首先，如果没有各级空军官兵（从新兵到空军指挥官）的勤奋和奉献，TASKORD '22 就不可能取得成功。我非常感谢每一位空军官兵的辛勤工作。其次，指挥部已准备好在成功的基础上继续推进 TASKORD '23。TASKORD '23 重申了“立即做好准备”和“面向未来转型”的优先事项。它强调了做好战斗准备并满足作战指挥要求的呼声。战斗准备意味着什么？它意味着满足你的发展、承诺和训练的要求。战斗准备的预备役公民飞行员在每次 UTA 和 IDT 期间都会磨练他们的技术和领导技能，因为他们在重返平民职业之前只有有限的时间成为其领域的专家。但正如每一位预备役公民飞行员所知，保持这种永久的准备状态并非易事。技能会萎缩。设备会损坏。健康状况会下降。虽然准备最终是个人责任，但你并不孤单。TASKORD '22 和 '23 的第二个优先事项“面向未来转型”是司令部如何帮助你履行准备义务。司令部正在授权你的联队指挥官和一线主管通过数据优势增强意识并提高责任感。我们这样做的方法之一是部署空军首批工具，帮助指挥官与空军人员合作，发现并解决战备不足问题。例如，
现已准备好 - 空军预备役司令部 - AF.mil
今年，我们向 75 年前创建空军预备役的男女官兵致敬。顺便说一句，今年也是 TASKORD '22 一周年，该计划优先考虑战备和转型。在今年的空军预备役指挥联队指挥官和指挥长会议期间，我有幸在与你们的联队长会面时对这两点进行了反思。在会议讨论中，我提出了两个主题。首先，如果没有各级空军官兵（从新兵到空军指挥官）的勤奋和奉献，TASKORD '22 就不可能取得成功。我非常感谢每一位空军官兵的辛勤工作。其次，指挥部已准备好在成功的基础上继续推进 TASKORD '23。TASKORD '23 重申了“立即做好准备”和“面向未来转型”的优先事项。它强调了做好战斗准备并满足作战指挥要求的呼声。战斗准备意味着什么？它意味着满足你的发展、承诺和训练的要求。战斗准备的预备役公民飞行员在每次 UTA 和 IDT 期间都会磨练他们的技术和领导技能，因为他们在重返平民职业之前只有有限的时间成为其领域的专家。但正如每一位预备役公民飞行员所知，保持这种永久的准备状态并非易事。技能会萎缩。设备会损坏。健康状况会下降。虽然准备最终是个人责任，但你并不孤单。TASKORD '22 和 '23 的第二个优先事项“面向未来转型”是司令部如何帮助你履行准备义务。司令部正在授权你的联队指挥官和一线主管通过数据优势增强意识并提高责任感。我们这样做的方法之一是部署空军首批工具，帮助指挥官与空军人员合作，发现并解决战备不足问题。例如，
KEK科学咨询委员会第五次会议的报告
kek为来自日本和国外的学术界和工业的研究人员带来了独特的科学机会，涵盖了加速器科学，粒子物理，核物理，宇宙学，材料科学和生命科学。Kek分别在其Tsukuba和Tokai校园内运营并开发了世界领先的电子和基于质子的加速器设施。使用来自这些设施的各种梁，Kek研究了自然的基本定律和材料功能特性的起源。SAC在KEK目前正在进行的大量活动印象深刻。这些活动的水平很高，通常在国际上具有竞争力。Superkekb和Belle II有望在2024年数据获取的亮度和探测器性能方面具有出色的开端。Superkekb长时间关闭后，LS1，碰撞于2024年2月重新启动。在关闭之前已经达到的高光度非常令人鼓舞，并将中期目标置于10 35 cm-2 s-1孔。随着这种持续改进，Belle II将保留在风味物理的前沿，在LS2之前，LS2的光度为2×10 35 cm -2 s -1的目标。它在与CERN的LHCB保持竞争性方面的成功将取决于提供的大量梁时。6×10 35 cm -2 s -1的亮度的长期目标仍然是一个重大挑战。SAC期待2024年预期的进度。，由于SuperKekb在KEK设施中具有最高的功率需求，因此实现这一目标将需要管理层大量的努力。国际社会兴奋地等待了Hyper-Kamiokande项目。在快速提取质子束中的进展非常令人印象深刻，显示出稳定的763kW操作。到2027年，质子束功率为1.2MW的目标，即Hyper-Kamiokande的开始。SAC还期待着有关近探测器开发的进度报告，其发展必须与光束发展相吻合。在ICFA国际发展团队（IDT）和日本HEP社区的鼓励下，Kek从MEXT获得了ILC技术网络（ITN）的五年资金，从而使ILC开发资金增加了一倍。这已经为欧洲的ILC提供了额外的支持。
陆军农业兵职位空缺公告编号：25-VA-07
职位标题：Admin NCO开放日期：2025年2月7日截止日期：2025年3月8日，税务站：第50届化学公司，汉密尔顿街1060号汉密尔顿街萨默塞特，NJ 08873 MOS：74D军事级：此公告向E5年级的人员开放，E6级士兵（欢迎使用E6的士兵，但将适用于Voluct of Voluct自愿减少到E5的士兵必须考虑其保留控制点（RCP）的积极服务要求）。考虑区域：拥有军事级和MOS的新泽西陆军国民警卫队的现任成员。特别要求：除非已经完成，否则将在PEC的12个月内安排士兵在PEC的ARNG基本人力资源和管理课程。税务描述：就物流，培训，人员和准备要求的指挥官提供建议。负责士兵的要求，并确保士兵在开始日期之前符合所有课程先决条件。协助指挥官起草培训时间表，这些时间表符合指挥指导和高级指令和出版物，协助维护该单位以及相关的培训设备和艾滋病，并监督所有内部和外部ATRR的输入，并为指挥官提供每周更新。职责包括管理管理职能（NOVAL，ETS报告，分离数据包和评估报告，包括OER和NCOER）。包括以下内容（但不限于：审查，更新和输入士兵人员数据，可以及时地融入IPPSA，IPERMS和EES。协助维护和管理UMR，力量报告和LOD。协助准备每天，每周，每月，季度和年度人员报告，以提交给高级总部和员工元素。必须能够获得所有必需的培训和人力资源系统的访问和知识：IPPS-A，IPERMS，DPRO，MEDPROS，MEDCHART，EES，EES，DAMPS-ORDERS，DAMPS-OCOTCS，MARRS-N，MARRS-N，DTMS，ATTRS，ATTRS，ATTRS，ATTRS和我的单位工资。负责提交和跟踪众多培训支持请求（IDT）和年度培训（AT）任务。
CVM 院内
先前已从皮肤活检中收获了原代真皮犬成纤维细胞。使用人类端粒酶逆转录酶 (hTERT) 对真皮犬成纤维细胞进行永生化，以从每个供体 (PDK4 野生型或 wt/wt、PDK4 杂合子或 wt/del、PDK4 纯合子或 del/del) 中创建永生化细胞系。这些细胞将在含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素抗真菌剂的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基的 6 孔板中接种和培养。将使用 QuickExtractTM DNA 提取溶液提取 DNA。将使用 Thermo Scientific NanoDropTM 1000 分光光度计对 DNA 进行分光光度定量。提取 DNA 后，将对 PDK4wt/wt 和 PDK4del/del 细胞中的 PDK4 基因进行 PCR 扩增。扩增后，将使用 DNA Clean & Concentrator™-25 试剂盒纯化 PCR 产物以进行裸 DNA 切割反应。兽医学学生将测试一种名为 KKH 的新酶，它是 Cas9 变体，可在不同的 PAM 或识别位点切割 DNA。我们使用计算方法确定 KKH 将在 PDK4 基因中所需的切割位点切割，从而有效地为插入双链寡脱氧核苷酸 (dsODN) 探针腾出空间。该 DNA 片段将通过同源重组将缺失的 16 个碱基对添加到基因中。已经设计了两个 dsODN，它们包含“丢失的外显子”序列以及与 DCM1 相关的缺失的 16 个碱基对，并将通过核转染反应测试它们是否掺入细胞 DNA 中。dsODN1 由 DCM1 突变两侧的 300 个碱基组成，dsODN2 由突变两侧的 350 个碱基组成。正向和反向引物组将由 Integrated DNA Technologies（IDT，美国爱荷华州科勒尔维尔）合成。将对每个引物组进行 PCR 梯度，退火范围为 dsODN1 的 55°C 至 67°C 和 dsODN2 的 54°C 至 64°C。目标是将缺失的 PDK4 片段插入切割的 DNA 中，并将在体内缺失 16 个碱基对的成纤维细胞中使用核转染试验进行测试。此后，将从细胞中提取 DNA 并评估整合效果。
与长期水族馆设施中的热带八放珊瑚相关的四种新型 Endozioicomonas 菌株的基因组序列
我们报告了从葡萄牙里斯本海洋馆 19 立方米热带展览水族馆中保存的两个 Litophy ton sp. 标本中分离出的四种 Endozoicomonas 菌株的基因组。如前所述 (2) 回收宿主衍生的微生物细胞悬浮液。将一克珊瑚组织在 9 mL 无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - 人工海水中均质化 (2)。将匀浆连续稀释，分别接种在 1:2 稀释的海洋琼脂和 1:10 稀释的 R2A 培养基上，并在 21°C 下孵育 4 周。使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 (Promega, USA) 从 1:2 海洋肉汤中新鲜生长的培养物中提取单个菌落的基因组 DNA。使用通用引物 (F27 和 R1492) 从基因组 DNA 中扩增 16S rRNA 基因，通过 Sanger 测序来确认纯度。使用 SILVA 比对、分类和树服务 (v1.2.12) 和数据库 (v138.1) 进行分类分配。使用 PacBio 测序技术 (5)，相同的基因组 DNA 样本在 DOE 联合基因组研究所 (JGI) 进行基因组测序。对于每个样本，将基因组 DNA 剪切至 6-10 kb，使用 SMRTbell Express Template Prep Kit 3.0 进行处理，并用 SMRTbell 清理珠 (PacBio) 进行纯化。使用条形码扩增寡核苷酸 (IDT) 和 SMRTbell gDNA 样本扩增试剂盒 (PacBio) 富集纯化产物。构建了 10 kb PacBio SMRTbell 文库，并使用 HiFi 化学在 PacBio Revio 系统上进行测序。使用 BBTools v.38.86 ( http://bbtools.jgi.doe.gov ) 根据 JGI 标准操作规范 (SOP) 协议 1061 对原始读段进行质量过滤。使用 Flye v2.8.3 (6) 组装过滤后的 >5 kb 读段。生物体和项目元数据存放在 Genomes OnLine 数据库中 (7)。使用 NCBI 原核基因组注释流程 (PGAP v.6.7) (8) 和 DOE-JGI 微生物基因组注释流程 (MGAP v.4) (9) 对重叠群进行注释，并与集成微生物基因组和微生物组系统 v7 (IMG/M) 相结合进行比较分析 (10)。使用 CheckM 评估基因组完整性和污染
与长期水族馆设施中的热带八放珊瑚相关的四种新型 Endozioicomonas 菌株的基因组序列
我们报告了从葡萄牙里斯本海洋馆 19 立方米热带展览水族馆中保存的两个 Litophy ton sp. 标本中分离出的四种 Endozoicomonas 菌株的基因组。如前所述 (2) 回收宿主衍生的微生物细胞悬浮液。将一克珊瑚组织在 9 mL 无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - 人工海水中均质化 (2)。将匀浆连续稀释，分别接种在 1:2 稀释的海洋琼脂和 1:10 稀释的 R2A 培养基上，并在 21°C 下孵育 4 周。使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 (Promega, USA) 从 1:2 海洋肉汤中新鲜生长的培养物中提取单个菌落的基因组 DNA。使用通用引物 (F27 和 R1492) 从基因组 DNA 中扩增 16S rRNA 基因，通过 Sanger 测序来确认纯度。使用 SILVA 比对、分类和树服务 (v1.2.12) 和数据库 (v138.1) 进行分类分配。使用 PacBio 测序技术 (5)，相同的基因组 DNA 样本在 DOE 联合基因组研究所 (JGI) 进行基因组测序。对于每个样本，将基因组 DNA 剪切至 6-10 kb，使用 SMRTbell Express Template Prep Kit 3.0 进行处理，并用 SMRTbell 清理珠 (PacBio) 进行纯化。使用条形码扩增寡核苷酸 (IDT) 和 SMRTbell gDNA 样本扩增试剂盒 (PacBio) 富集纯化产物。构建了 10 kb PacBio SMRTbell 文库，并使用 HiFi 化学在 PacBio Revio 系统上进行测序。使用 BBTools v.38.86 ( http://bbtools.jgi.doe.gov ) 根据 JGI 标准操作规范 (SOP) 协议 1061 对原始读段进行质量过滤。使用 Flye v2.8.3 (6) 组装过滤后的 >5 kb 读段。生物体和项目元数据存放在 Genomes OnLine 数据库中 (7)。使用 NCBI 原核基因组注释流程 (PGAP v.6.7) (8) 和 DOE-JGI 微生物基因组注释流程 (MGAP v.4) (9) 对重叠群进行注释，并与集成微生物基因组和微生物组系统 v7 (IMG/M) 相结合进行比较分析 (10)。使用 CheckM 评估基因组完整性和污染
使用 CRISPR-Cas9 作为限制性酶
图表列表 图 1.1：限制性酶的发现时间表及一般历史里程碑……………………………………………………………………………………………………… 2 图 1.2：中心法则图…………………………………………………………………… 4 图 1.3：不同类型的限制性酶；ZFN 和 TALEN 序列特异性分别与特定三联体或有限特定 bp 序列有关。粉红色高亮表示所示限制性酶或内切酶的结合位点。粗线表示切割位点………………………………………………………… 5 图 1.4：CRISPR-Cas9 系统的功能组件（Bortesi, L. 和 Fischer, R.，2014 年）。面板 (a) 显示了 Cas9 正常发挥功能所必需的各个 RNA 组件。图 (b) 显示 RNA 成分连接在一起形成 sgRNA 序列。……………………………………………………………………...… 8 图 3.1：设计引物的 Lambda DNA 凝胶电泳（目标大小 1000bp）。孔 1 显示大小标准（以“M 表示），孔 2 和 3 显示成功 PCR …………………………………………………………………………………..... 20 图 3.2：基于 Origene 的 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳。含有梯状物的孔标记为“L”。含有未切割的 PCR 产物储备孔标记为“P”。标签 2/3、1X 和 4X 表示反应中使用的 DNA 浓度。标准浓度为 1X。孔 2-4、6-8、10-12、14-16、18 和 19 显示 CRISPR/Cas9 反应产物 .……………………………….…….….… 21 图 3.3：基于 Origene 的改良版 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳图，其中模板 DNA 浓度和 Cas9 试剂浓度均增加。含有梯度的孔标记为“L”。含有未切割的 PCR 产物原料孔标记为“P”。孔 3-6、7、8、10-13、14 和 15 含有 CRISPR/Cas9 反应产物。所有反应均含有 10uL 模板 DNA .…………………………………………………..……………………..……...…. 22 图 3.4：基于 IDT 的改良版 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳图。含有梯状物的孔标有“L”。含有未切割的 PCR 原液产物的孔标有“P”。孔 2 不含任何产物。孔 3-6、7-10 和 11-14 含有 CRISPR/Cas9 反应产物。所有反应均含有 tracrRNA。孔 11-14 含有 3 倍量（uL）的模板 DNA……… ...