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通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。
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2017 年 12 月 20 日，星期三，发行 2018 年 1 月 3 日星期三 2017 年 12 月 27 日，星期三，发行 2018 年 1 月 10 日星期三 1 月 3 日，星期三，发行 2018 年 1 月 17 日星期三 1 月 10 日，星期三，发行 2018 年 1 月 24 日星期三 1 月 17 日，星期三，发行 2018 年 1 月 31 日星期三 1 月 24 日，星期三，发行 2018 年 2 月 7 日星期三 2 月 31 日，星期三，发行 2018 年 2 月 14 日星期三 2 月 7 日，星期三，发行 2018 年 2 月 21 日星期三 2 月 14 日，星期三，发行 2018 年 2 月 28 日星期三3 月 7 日，星期三，发行日期为 2018 年 3 月 21 日星期三 3 月 14 日，星期三，发行日期为 2018 年 3 月 28 日星期三 3 月 20 日，星期二，发行日期为 2018 年 4 月 4 日星期三 3 月 28 日，星期三，发行日期为 2018 年 4 月 11 日星期三 4 月 4 日，星期三，发行日期为 2018 年 4 月 18 日星期三 4 月 11 日，星期三，发行日期为 2018 年 4 月 25 日星期三 4 月 18 日，星期三，发行日期为 2018 年 5 月 2 日星期三 4 月 25 日，星期三，发行日期为 2018 年 5 月 9 日星期三 5 月 2 日，星期三，发行日期为 2018 年 5 月 16 日星期三2018年5月30日星期三，针对