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干细胞研究-ISCIII
行为（图1 b），它们对碱性磷酸酶活性呈阳性（图1 c）。我们确定了八个培养通道后通过RT-PCR清除载体和外源重编程因子基因（图1 D）。还通过RT-PCR评估了多能相关转录因子Oct4，Sox2，Klf4，Nanog，Cripto和Rex1的内源性表达（图1 e）。免疫荧光分析表明，转录因子Oct4，Nanog，Sox2和表面标记物SSEA3，SSEA4，TRA1-60和TRA1-81多能ES细胞的特征（图1 f）。多能相关基因，Oct4和Nanog的启动子，在原始纤维细胞中重大甲基化的N44SV.5线几乎被脱甲基，这表明表观遗传重编程至多能性（图1 g）。IPSC系列已适应了无馈物培养条件，并在二十多个培养通道后显示出正常的核型（46，XY）（图1 h）。我们还通过DNA填充分析来确认，N44SV.5是源自原始细胞的（图1 I）。最后，使用基于胚胎的身体在体外测试了生成的IPSC线分化为三个胚芽层（内膜，中胚层和外胚层）的能力（图
（DNA-结合蛋白Pull-down） 货号
NCOA3是通过ESRRB招募到目标基因座的ERRE的。（a）使用先前描述的野生型（WT）或ERRE突变序列的DNA下拉测定法（Feng et al。2009）或Nanog（van den Berg等人 2008）。 生物素化探针（40–50-50碱基对[BP]）与来自Flag-EsRRB和NCOA3转染的COS-1细胞的提取物一起孵育，并在链霉亲蛋白珠上回收，并通过Western Blotting可视化与DNA相关的蛋白质。 （b）ESRRB，KLF4，NANOG和SOX2 ERRES的ESRRB和NCOA3富集水平以及一个基因（Inter。） 通过CHIP和QPCR评估的ESC中的控制区域，并相对于输入表示。 数据是三个生物学重复的平均6 SEM。 （c）ESRRB耗竭后的候选基因座的NCOA3和ESRRB富集水平相对于输入表示。 在每个实验中，富集SHGFP转染的细胞的富集设置为100％。 数据是至少两个独立实验的平均6 SD。 B和C中的虚线表示对照IgG（Santa Cruz Biotechnology）的背景富集。 （d）蛋白质印迹显示特定的ESRRB蛋白耗竭后48小时用ShesRRB转染。 请注意，此时NCOA3和OCT4级别不变。 （E）使用Nanog野生型或ERRE突变探针的DNA下拉分析，该探针还包含相邻的OCT – SOX位点（Van Den Berg等人 2008），并从NCOA3，OCT4和SOX2转染的COS-1提取细胞提取物。2009）或Nanog（van den Berg等人2008）。 生物素化探针（40–50-50碱基对[BP]）与来自Flag-EsRRB和NCOA3转染的COS-1细胞的提取物一起孵育，并在链霉亲蛋白珠上回收，并通过Western Blotting可视化与DNA相关的蛋白质。 （b）ESRRB，KLF4，NANOG和SOX2 ERRES的ESRRB和NCOA3富集水平以及一个基因（Inter。） 通过CHIP和QPCR评估的ESC中的控制区域，并相对于输入表示。 数据是三个生物学重复的平均6 SEM。 （c）ESRRB耗竭后的候选基因座的NCOA3和ESRRB富集水平相对于输入表示。 在每个实验中，富集SHGFP转染的细胞的富集设置为100％。 数据是至少两个独立实验的平均6 SD。 B和C中的虚线表示对照IgG（Santa Cruz Biotechnology）的背景富集。 （d）蛋白质印迹显示特定的ESRRB蛋白耗竭后48小时用ShesRRB转染。 请注意，此时NCOA3和OCT4级别不变。 （E）使用Nanog野生型或ERRE突变探针的DNA下拉分析，该探针还包含相邻的OCT – SOX位点（Van Den Berg等人 2008），并从NCOA3，OCT4和SOX2转染的COS-1提取细胞提取物。2008）。生物素化探针（40–50-50碱基对[BP]）与来自Flag-EsRRB和NCOA3转染的COS-1细胞的提取物一起孵育，并在链霉亲蛋白珠上回收，并通过Western Blotting可视化与DNA相关的蛋白质。（b）ESRRB，KLF4，NANOG和SOX2 ERRES的ESRRB和NCOA3富集水平以及一个基因（Inter。）通过CHIP和QPCR评估的ESC中的控制区域，并相对于输入表示。数据是三个生物学重复的平均6 SEM。（c）ESRRB耗竭后的候选基因座的NCOA3和ESRRB富集水平相对于输入表示。在每个实验中，富集SHGFP转染的细胞的富集设置为100％。 数据是至少两个独立实验的平均6 SD。 B和C中的虚线表示对照IgG（Santa Cruz Biotechnology）的背景富集。 （d）蛋白质印迹显示特定的ESRRB蛋白耗竭后48小时用ShesRRB转染。 请注意，此时NCOA3和OCT4级别不变。 （E）使用Nanog野生型或ERRE突变探针的DNA下拉分析，该探针还包含相邻的OCT – SOX位点（Van Den Berg等人 2008），并从NCOA3，OCT4和SOX2转染的COS-1提取细胞提取物。富集SHGFP转染的细胞的富集设置为100％。数据是至少两个独立实验的平均6 SD。B和C中的虚线表示对照IgG（Santa Cruz Biotechnology）的背景富集。（d）蛋白质印迹显示特定的ESRRB蛋白耗竭后48小时用ShesRRB转染。请注意，此时NCOA3和OCT4级别不变。（E）使用Nanog野生型或ERRE突变探针的DNA下拉分析，该探针还包含相邻的OCT – SOX位点（Van Den Berg等人2008），并从NCOA3，OCT4和SOX2转染的COS-1提取细胞提取物。
CRISPR/Cas9 介导的 ELANE 敲除可使原代造血干细胞和祖细胞以及诱导性多能干细胞中性粒细胞成熟
PRE CTGGGCTACACTGAGCACC TGACAGGTGGTGGCAATGCC OCT4 CCTCACTTCACTGCACTGTA CAGGTTTTCTTTCCCTAGCT SOX2 TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG C NANOG TCACACGGAGACTGTCTCTC GAACACAGTTCTGGTCTTCTG ABCG2 TACCTGTATAGTGTACTTCAT GGTCATGAGAAGTGTTGCTA chr12 位置 (24306644) TCTTCTTCAGGCTTTGCTTGCAGG GGTAGGAGTAGAAGGGTGGC OR2W4P GTGGGTTTCTCTGATCGTCCCA GGAAGAACTGTTCCTGGCTGC GPR107 CTGCCAAGCTGCTGTACTTCAA TCTTACGTGCTCCAAAGGCTGA BiP AGGACAAGAAGGAGGACGTGG GGTTGGAGGTGAGCTGGTTC Bcl-XL GGGTTCCCTTTCCTTCCATC AGTGGCCCCTAAATGGCTCT
MACC1调节LGR5以促进结直肠癌的癌症干细胞特性
从HIV-1 + 2，乙型肝炎和丙型肝炎中分离出外周血单核细胞（PBMC）。pBMC，包括人类基因Oct3/4，Sox2，c-Myc和klf4的矢量。HIPSC线BIHI292-A源自单个菌落，并在E8培养基中保持未分化的HIPSC的典型形态（图1 a）。通过PCR确认缺乏仙台病毒载体（Suppl。图1 a）。BIHI292-A HIPSCS ECT3/4，SSEA-4，NANOG和TRA-1 - 60作为未分化HIPSC状态的典型标记，如使用免疫细胞化学所示（图1 b）。进一步的流式细胞仪证实了OCT3/4，SSEA-4，NANOG和TRA-1-60表达在超过96％的BIHI292-A HIPSC中的SSEA-4，Nanog和Tra-1-60表达中的干性标记表达（图。1 c）。g带核分型在GTG上进行（使用GIEMSA的胰蛋白酶G带）进行染色的中期染色体，并揭示了正常的雌性Karyo 46型，XX（图1 D）。 单核苷酸多态性分析表明，与患者的PBMC相比，BIHI292-A HIPSC线没有任何拷贝数变量> 2 Mb> 2 MB> 5 MB（表1）。 短串联重复（STR）分析的结果表明，BIHI292-A细胞系和患者的PBMC的遗传认同是相同的（表1）。 Sanger测序证实了两个Exon 2中的两个Trem2杂合突变C.313del（P.Ala105fs）和C.199del（p。is67fs）（图） 1 e）。 图1 D）。单核苷酸多态性分析表明，与患者的PBMC相比，BIHI292-A HIPSC线没有任何拷贝数变量> 2 Mb> 2 MB> 5 MB（表1）。短串联重复（STR）分析的结果表明，BIHI292-A细胞系和患者的PBMC的遗传认同是相同的（表1）。Sanger测序证实了两个Exon 2中的两个Trem2杂合突变C.313del（P.Ala105fs）和C.199del（p。is67fs）（图1 e）。图为了确认患者突变的存在（Buthut等，2023），在TREM2基因的外显子2中为复合杂合突变进行了BIHI292-A HIPSC的测序。通过将分化为三个细菌层的细胞进行分化，测试了多能分化势。分化测试证实，BIHI292-A HIPSC具有分化为内胚层（CD184 +，SOX17 +），Meso Dermal（CD140B +，CD144 +）和外胚层（PAX-6 +，SOX2 +）细胞的潜力（1 f）。BIHI292-A HIPSC对支原体进行了阴性测试（Suppl。1 b）。
产生大肠杆菌素的大肠杆菌通过促进上皮-间质转化和癌症干细胞出现来增强对化疗药物的耐药性
摘要 人类结直肠癌 (CRC) 很容易被产生大肠杆菌素的大肠杆菌 (CoPEC) 定殖。CoPEC 会诱发 DNA 双链断裂、DNA 突变、基因组不稳定性和细胞衰老。受感染的细胞会产生衰老相关分泌表型 (SASP)，这与在感染 CoPEC 的 CRC 小鼠模型中观察到的肿瘤发生率增加有关。本研究调查了 CoPEC 以及源自 CoPEC 感染细胞的 SASP 是否影响化疗耐药性。用 CoPEC 临床 11G5 菌株或其同源突变体感染人类肠上皮细胞，后者无法产生大肠杆菌素。在体外和异种移植小鼠模型中评估了化疗耐药性。研究了受感染细胞中癌症干细胞 (CSC) 标志物的表达。使用 CRC 小鼠模型和人类临床样本验证数据。 11G5 感染细胞和与 11G5 感染细胞产生的 SASP 一起孵育的未感染细胞均在体内和体外表现出对化疗药物的抵抗力增强。这一发现与上皮-间质转化 (EMT) 的诱导相关，这导致出现具有 CSC 特征的细胞。它们在超低附着平板上生长，在软琼脂中形成菌落，并过度表达几种 CSC 标志物（例如 CD133、OCT-3/4 和 NANOG）。与这些结果一致的是，与缺乏 CoPEC 的活检相比，被 CoPEC 定植的小鼠和人类 CRC 活检显示出更高的 OCT-3/4 和 NANOG 表达水平。结论：CoPEC 可能通过诱导对化疗具有高度抵抗力的癌症干细胞的出现来加重 CRC。
AXL-PYK2-PKCα轴作为TNBC中的茎回路的联系
癌症干细胞（CSC）与肿瘤的启动，美味和耐药性有关，并被认为是癌症治疗的有吸引力的靶标。在这里，我们鉴定了由AXL受体，PYK2和PKCα介导的临床相关的Nexus，并显示了其对TNBC中干性的影响。AXL，PYK2和PKCα表达与基础类乳腺癌患者的干性特征相关，并且在多个间充质TNBC细胞系中它们的耗竭显着减少了乳球形成细胞的数量和具有CSCS特征性标记的细胞的数量。敲低PYK2可降低AXL，PKCα，FRA1和PYK2蛋白的水平，并在PKCα耗竭后获得了类似的趋势。 pyk2 depletion通过FRA1和TAZ介导的反馈回路降低了AXL转录，而PKCα抑制作用诱导AXL将AXL重新分布为内体/溶酶体隔室并增强其降解。 pyk2和pkcα在多个诱导型AXL水平的多个诱导途径的途径上进行合作，并同时使用STAT3，TAZ，FRA1和SMAD3的水平/激活以及多能转录因子NANOG和OCT4。 TNBC敏感性细胞对PYK2和PKCα抑制的诱导，这表明靶向AXL-PYK2-PKCα回路可能是消除TNBC中CSC的有效策略。敲低PYK2可降低AXL，PKCα，FRA1和PYK2蛋白的水平，并在PKCα耗竭后获得了类似的趋势。pyk2 depletion通过FRA1和TAZ介导的反馈回路降低了AXL转录，而PKCα抑制作用诱导AXL将AXL重新分布为内体/溶酶体隔室并增强其降解。pyk2和pkcα在多个诱导型AXL水平的多个诱导途径的途径上进行合作，并同时使用STAT3，TAZ，FRA1和SMAD3的水平/激活以及多能转录因子NANOG和OCT4。TNBC敏感性细胞对PYK2和PKCα抑制的诱导，这表明靶向AXL-PYK2-PKCα回路可能是消除TNBC中CSC的有效策略。
第一天：量子安全IPSEC VPN
Melchior Aelmans是一位经验丰富的建筑师，在云和服务提供商行业的各种运营，工程和建筑角色中拥有20多年的经验。他目前是Juniper Networks全球服务提供商架构团队的成员，在那里他与服务提供商合作设计和发展其网络。Melchior对量子技术和网络安全的交集特别感兴趣，并专注于探索自2018年以来在该领域应用量子技术的方法。除了他在量子技术方面的工作外，梅尔基奥（Melchior）对路由协议标准制定，路由安全性和网络体系结构充满热情。他是会议和会议的经常演讲者和与会者，包括积极参与IETF等标准化组织。作为曼尔斯的指导委员会成员，梅尔基奥尔致力于促进互联网的安全性，可靠性和稳定性。他还担任互联网社会组织成员咨询委员会联席主席，Nanog计划委员会成员和NLNOG基金会的董事会成员。
2022; 18(6): 2235-2248. doi: 10.7150/ijbs.64943 研究论文 ALKBH5 通过诱导 m6A 去甲基化促进多发性骨髓瘤致瘤性
N6-甲基腺苷 (m 6 A) 是高等真核生物中最常见的 RNA 修饰。ALKBH5 是一种影响 RNA 输出和代谢的 RNA 去甲基化酶，其异常表达与肿瘤的产生有关。在本研究中，我们发现 ALKBH5 在从多发性骨髓瘤 (MM) 患者中分离的原代 CD138 + 浆细胞和 MM 细胞系中均高表达。ALKBH5 下调可抑制骨髓瘤细胞增殖、新生血管形成、侵袭和迁移能力，并在体内和体外促进细胞凋亡。MeRIP-seq 确定 SAV1 基因是 ALKBH5 的主要靶基因。在 MM 细胞中抑制 ALKBH5 会增加 SAV1 m 6 A 水平，降低 SAV1 mRNA 的稳定性和表达，抑制干细胞相关的 HIPPO 通路信号传导并最终激活下游效应物 YAP，发挥抗骨髓瘤作用。此外，在 ALKBH5 缺乏的细胞中，MM 干细胞表型受到抑制，多能性因子 NANOG、SOX2 和 OCT4 的表达也下降。总之，我们的结果表明 ALKBH5 在 MM 中充当致癌基因，可能成为有吸引力的潜在生物标志物和治疗靶点。
klf17促进了人类幼稚的多能性，但并不需要其建立
当前对人类多能性的转录调控的知识是不完整的，缺乏种间保护。对人类胚胎的单细胞转录组学分析以前使我们能够鉴定出富含人层和幼稚的人类胚胎干细胞（HESC）的转录因子，包括锌指蛋白KLF17。在这里，我们表明KLF17与人类胚泡发育中已知的多能相关因素Nanog和Sox2表示同时表达。我们使用启动和幼稚的hESC来研究KLF17的功能，以获得功能丧失分析。我们发现，在启动hESC中KLF17的异位表达足以诱导幼稚的转录组，并且KLF17可以驱动转基因介导的重置以重置为幼稚的多能性。这意味着KLF17在建立幼稚的多能性中的作用。然而，CRISPR-CAS9介导的敲除研究表明，在体外幼稚的多能习得并不需要KLF17。幼稚hESC的转录组分析鉴定了KLF17功能丧失后对代谢和信号通路的微妙影响，并可能与其他KLF旁系同源物进行冗余。总体而言，我们表明KLF17在给定的体外条件下的幼稚多能性是足够但不是必需的。
评估三维神经母细胞瘤球体细胞培养模型中的RIST分子靶向方案
摘要：背景：高危神经母细胞瘤患者的结果仍然很差，并且迫切需要新的治疗策略。RIST方案代表了一种新型的计量和多模式治疗策略，用于将分子靶向药物作为“预处理”与常规化学疗法主链结合的高危神经细胞瘤，目前在II期临床试验中进行了评估。用于临床前药物测试，与mo-nolayer培养物相比，癌细胞的生长是球体的优势，因为它重现了广泛的肿瘤特征，包括三维结构和癌症干细胞（CSC）特性。这项研究的目的是建立一个神经母细胞瘤模型，以严格评估RIST治疗方案。方法：通过mRNA和蛋白质分析和球体生存能力通过基于发光的测定进行评估CSC标记表达。通过组织微阵列分析和患者数据挖掘评估RNA结合蛋白LA在神经母细胞瘤中的异常表达。结果：与单层培养物相比，球体培养物显示出较高的CSC样标记（CXCR4，Nanog和BMI）亚组的表达和更高的THR389磷酸化表达。球体靶向分子的“预处理”降低了肿瘤信号传导和CSC标记表达。结论：RIST治疗方案有效地降低了以晚期CSC特性为特征的神经母细胞瘤球体的活力。