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CRISPR-Cas9 介导的大簇删除和...
图 5 . 基于 CRISPR-Cas9 的 pepC 和 sacB 基因多重基因组编辑。（A）以 mRFP 或 sfGFP 为目的基因的单基因缺失、多重缺失和多重整合的结合和编辑效率。Y 轴上提供结合效率（灰色）和编辑效率（橙色）。编辑效率条顶部的数字表示筛选的接合子总数。误差线表示标准偏差。在确定编辑效率之间的显著差异时，考虑 P 值 < 0.05（* p < 0.05；** p < 0.01）。与单基因缺失和多重缺失相比，多重 mRFP 整合具有显著差异，与单基因缺失相比，多重 sfGFP 整合也具有显著差异。 (B) P. polymyxa 突变体的显微图像，其中 sfGFP 取代了 pepC 和 sacB 基因。(左) 明场图像；(右) GFP 通道。(C) 筛选过程中获得的野生型和突变体的比例以饼状图形式提供。
量身定制的胞外多糖——CRISPR-Cas9 介导的多粘芽孢杆菌基因组编辑
MoBiTec GmbH pCasPP P. polymyxa 基因组编辑载体 本研究 pCasPP-pepFsg1 pepF 靶向敲除质粒不提供修复模板 本研究 pCasPP-pepFsg1-harms pepF 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepFsg2-harms pepF 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepF-harms 未靶向的 pCasPP 衍生物携带 pepF 同源区 本研究 pCasPP-pepCsg1-harms pepC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepCsg2-harms pepC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepJsg1-harms pepJ 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-pepJsg2-harms pepJ 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-ugdH1sg1-harms ugdH1 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-ugdH1sg2-harms ugdH1 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-manCsg1-harms manC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-manCsg2-harms manC 靶向敲除质粒提供修复模板 本研究 pCasPP-clugBlock-harms 多重 pCasPP 变体，同时靶向两个不同位点，用于敲除 18 kb 片段；提供同源区域
改进高粱转化和基因组编辑，开发稳定品系，用于光合和水分利用效率分析
通过使用基因组编辑和稳定植物转化技术，开发将高粱基因与表型联系起来的基因组水平知识库以实现生物能源目标，对于理解基本生理功能和作物改良至关重要。我们与参与该项目的各个实验室一起贡献中央枢纽能力，以创建、测试和培育转基因和基因组编辑植物。我们已经建立了可靠的协议，用于通过农杆菌介导将实验性遗传构建体引入高粱 cv BTx430，并合作生成该项目正在进行的研究所需的可行转基因。这些实验包括：； (1) 用于敲低的高粱 RNAi 构建体，例如电压门控氯离子通道蛋白、α碳酸酐酶 7 (CA) 和 9-顺式环氧胡萝卜素双加氧酶 4 以及 myb 结构域蛋白 60； (2) 构建体用于测试磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC) 启动子表达、CA 过表达和具有改变动力学的 PEPC 的保真度；(3) 旨在测试一系列增加的叶肉 CA 活性的 CA 过表达的其他版本；(4) Ta Cas 9、dTa Cas9 和 dCas9 转录激活因子用于改进编辑，以及；(5) 构建体用于评估转基因过程的改进，旨在增加转化频率并缩短 T1 种子的时间。这些品系目前处于转基因过程的不同阶段。使用形态发生调节剂介导的转化 (MRMT) 的最新发展是实现快速转化和基因组编辑的突破。我们报告了一种使用 MMRT 技术的改进的快速转化方法的开发，该方法有可能增加我们的项目的吞吐量并缩短时间。与 Voytas 实验室合作，我们评估了 MRMT 载体的公共版本。 Voytas 实验室还在测试递送基因组编辑试剂的新方法，特别是使用 RNA 病毒载体通过感染递送 gRNA。通过感染进行可遗传基因编辑已在多个双子叶植物中实现，我们正在努力在狗尾草和高粱中实施该技术。
原发性代谢调整的自然变化决定了模型中的铵耐性。
酶活性通过用500μl的提取缓冲液进行vig口摇（20％（v/v）甘油，1％triton X-100（v/v），50 mm hepes – koH（ph 7.5），10 mm mgcl 2，1 mm edta，1％triton x-100（v/v），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（V/V），1％Triton X-100（v/v），1％X-100（v/v），1％MM emMM MM E.酸，1 mm苯甲米丁，20μM亮肽素，0.5 mM DTT，1 mM苯基甲基磺酰基氟化物，10％聚乙烯基 - 丙吡咯烷酮（W/V）]。葡萄糖激酶（GK），FRUC TOKINAPE（FK），谷氨酸脱氢酶（GDH），磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC），苹果酸脱氢酶（MDH），丙酮酸激酶（PK），总浓酸酯（CM），米尔酸酯（CS），米尔酸酯（CM），米尔酸酯（CM）通过分光光度法测定NADP依赖性的异戊酸脱氢酶（ICDH）酶，并用机器化的微孔板测定法测定（Gibon等人。，2004）。在25°C孵育后，NAD（P）H的演变在340 nm处被固定在340 nm处。通过循环反应在570 nm处测量了GDH的活性，涉及在存在醇脱氢酶和苯嗪硫代硫酸盐的情况下，涉及3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑四唑。cs ac ac titive。（2003）。通过检查生物标准（番茄叶提取物）的恢复，并确保提取物的稀释对活动的估计没有影响，如Bénard和Gibon（2016）所述，可以通过检查生物标准的恢复（番茄叶提取物）来验证。
通过 C3 到 C4 工程改良作物的挑战和方法
随着世界人口的快速增长和自然资源的日益减少，我们现在面临着巨大的挑战，既要提高作物产量，又要提高资源利用效率。将 C4 光合作用引入 C3 作物被广泛认为是应对这一挑战的关键策略，因为 C4 植物在光合作用和资源利用方面比 C3 植物更有效率，特别是在生产力潜力巨大的炎热气候下。有证据表明，C4 光合作用是在多个谱系中从 C3 光合作用进化而来的，这为这种 C3 到 C4 工程的可行性提供了支持。然而，C3 到 C4 工程并非易事，因为必须将 C4 光合作用所必需的几个特征引入 C3 植物。其中一个特征是光合作用的两个阶段（CO 2 固定和碳水化合物合成）在空间上分别分离到叶肉细胞和束鞘细胞中。另一个特征是克兰兹解剖结构，其特点是叶肉细胞和束鞘 (BS) 细胞之间紧密相关（比例为 1:1）。这些解剖学特征与 C4 特异性碳固定酶 (PEPC) 一起形成了一种 CO 2 浓缩机制，可确保较高的光合作用效率。过去人们付出了很多努力将 C4 机制引入 C3 植物，但这些尝试都没有成功，我认为这是由于缺乏对 C3 和 C4 途径的系统级理解和操纵。作为 C3 到 C4 工程的先决条件，我建议不仅必须阐明控制 C3 和 C4 植物中 Kranz 解剖学和细胞类型特异性表达的机制，还必须充分了解 C3 和 C4 光合作用背后的基因调控网络。在这篇评论中，我首先描述了过去和当前为提高 C3 植物的光合作用效率所做的努力及其局限性；然后，我讨论了应对这一挑战的系统方法、一些实际问题以及有助于我们解决这些问题的最新技术创新。