CRISPR/CAS技术的常见应用涉及工程基因敲击素,其中DNA序列被取代或插入特定的基因组基因座。In contrast with CRISPR-mediated indels, which result from the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) pathway, gene knockins are often engineered via homology-directed repair (HDR), typically through the use of CRISPR reagents (Cas enzyme and guide RNA) in tandem with a DNA template that shares homology with the target site and encodes for the desired modification (Hsu et al., 2014;图1,下面)。用于HDR的模板可以是双链DNA(DSDNA,线性或质粒)或单链DNA(SSDNA),并且最近的发现表明,修复机制取决于使用的模板类型而变化。 dsDNA触发了一种反映减数分裂同源重组(HR)的RAD51依赖性机制,而HDR涉及ssDNA(称为单链模板修复或SSTR)是Rad51独立的,并且需要多个组件,并且需要多个组成部分的Fanconi Anemia Anemia(FA)维修路径(RICHARDARDSON ERATHEWAY(RICHARDARSEN)等。
☐ 质粒纯化配件 菌落筛选柱再生 无内毒素质粒分离 快速质粒分离 标准高纯度质粒分离 酵母质粒分离 ☐ 基因组 DNA 纯化柱再生 来自生物膜的 DNA 来自血液的 DNA 来自 FFPE 的 DNA 来自真菌的 DNA 来自昆虫和无脊椎动物的 DNA 来自植物的 DNA 来自唾液和法医样本的 DNA 来自土壤、粪便和水的 DNA 来自组织和细胞的 DNA 来自酵母和细菌的 DNA ☐ RNA 纯化 真菌、酵母和细菌 miRNA/mRNA 分离 来自生物膜的 RNA 来自血液的 RNA 来自 FFPE 的 RNA 来自昆虫、无脊椎动物和植物的 RNA 来自土壤的 RNA 来自组织和细胞的 RNA RNA 稳定化 RNA 合成试剂 总 RNA 试剂 ☐ 高通量 DNA/RNA 纯化提取系统 滤板高通量试剂盒 ☐ DNA 和 RNA 存储
116 试剂和酶。除非另有说明,试剂和酶均从 Sigma-Aldrich(英国)购买。碳网格(400 平方目铜)从 Micro to Nano(荷兰)购买,醋酸铀酰溶液由巴塞罗那自治大学的显微镜服务部门提供。Sup35- 121 SAC 肽从 CASLO ApS(Scion 丹麦技术大学)购买。122 蛋白质的表达和纯化。克隆到带有 His6 标签的质粒 pET28(a) 中的 Sup35- 123 5aa-DHFR 的 cDNA 是从 GenScript 获得的。通过在 128 质粒 pET28(a)/Sup35-5aa-DHFR 上进行诱变,获得了构建体 pET28(a)/Sup35-8aa- 126 DHFR、pET28(a)/野生型 DHFR (DHFR-wt) 和 pET28(a)/ 127 Sup35-5aa-DHFR-Z。用相应的质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)- 129 感受态细胞。130 然后,将转化细胞在 10 mL 溶源性肉汤 (LB) 中培养
图1:使用一系列不同的基于珠子和自旋柱的提取试剂盒从1 mL血浆重复中提取的平均DNA产量(Ng)。cfDNA,并洗脱50 µL洗脱缓冲液。DNA浓度。
•相同的规格;释放和稳定性时相似的纯度/杂质特征•相同的化学合成途径; 1.2倍较大的量•类似的原材料和试剂•类似的分析方法•DL过程绩效资格成功完成•经过良好的设施GMP并具有良好的代名词•满足DS Manufacturing的传入要求
Genexus™ 集成测序仪 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Genexus™ 模板条 3B - GX5™ 和 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Genexus™ 测序试剂盒 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ................. ...
摘要 定制寡核苷酸(oligos)是生物医学研究中广泛使用的试剂。寡核苷酸的一些常见应用包括聚合酶链式反应(PCR)、测序、杂交、微阵列和文库构建。寡核苷酸在这些应用中的可靠性取决于其纯度和特异性。本文报告,市售的寡核苷酸经常被非特异性序列(即其他不相关的寡核苷酸)污染。我们设计的用于扩增成簇的规律散布回文重复序列(CRISPR)指导序列的大多数寡核苷酸都含有非特异性的 CRISPR 指导序列。这些污染物是在从位于世界三个不同地理区域的八家商业寡核苷酸供应商处采购的研究级寡核苷酸中检测到的。对一些寡核苷酸的深度测序揭示了多种污染物。鉴于寡核苷酸的应用范围广泛,寡核苷酸交叉污染的影响因领域和实验方法的不同而有很大差异。在研究设计中加入适当的对照实验有助于确保寡核苷酸试剂的质量符合预期目的。这还可以根据寡核苷酸的用途将风险降至最低。
每组试剂在功能上进行了验证,并通过构建DNA库与以前的批次进行了验证。库由以前的和当前的批次制成的建议输入DNA量在同一Illumina®流动池中测序,并在各种指标上进行比较,包括库产量,读取与参考,GC偏置和插入尺寸的读取部分。
支持本研究结果的所有数据均包含在主要论文、补充图和补充表中。所用抗体和蛋白质试剂的列表见补充表 1。HDR 模板和 sgRNA 序列的列表见补充表 2 和 3。mRNA 编码 DNA 模板序列的列表见补充表 4。所有其他数据均可通过电子邮件联系相应作者索取。