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研究论文基于基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除筛选促进退出幼稚多能性的基因
干细胞和再生医学面临的两个主要问题是多能性的退出和向功能性细胞或组织的分化。这两个问题的答案对于干细胞和再生医学研究的临床转化具有重要意义。尽管越来越多的研究揭示了多能性维持的真相，但多能细胞自我更新、增殖和向特定细胞谱系或组织分化的机制尚不清楚。为此，我们充分利用了一项新技术，即基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除 (GeCKO)。作为一种在基因组特定位点引入靶向功能丧失突变的有效方法，GeCKO 能够首次以无偏向的方式筛选促进小鼠胚胎干细胞 (mESC) 退出多能性的关键基因。本研究成功建立了基于GeCKO的模型，用于筛选多能性退出的关键基因。我们的策略包括慢病毒包装感染技术、lenti-Cas9基因敲除技术、shRNA基因敲除技术、二代测序、基于模型的基因组规模CRISPR-Cas9敲除分析（MAGeCK分析）、GO分析等方法。我们的研究结果为大规模筛选多能性退出基因提供了一种新方法，为细胞命运调控研究提供了一个切入点。
2025; 21(4): 1545-1565. doi: 10.7150/ijbs.102079 研究论文高剂量抗坏血酸表现出抗增殖和抗侵袭作用，取决于
子宫内膜癌 (EC) 是最常见的妇科恶性肿瘤，通常以 PTEN 缺失、AKT/mTOR 通路激活为特征，对于复发和晚期患者有效治疗选择有限。高剂量抗坏血酸或与其他化疗药物联合使用在体内和体外均显示出强大的抗肿瘤作用。在本研究中，高剂量抗坏血酸显着抑制细胞增殖和侵袭，增加细胞应激和 DNA 损伤，并诱导 EC 细胞的细胞周期停滞和细胞凋亡。口服或腹膜内注射高剂量抗坏血酸 4 周可有效抑制 LKB1 fl/fl p53 fl/fl 小鼠 EC 模型中的肿瘤生长，且腹膜内注射比口服更有效。N-乙酰半胱氨酸部分逆转了抗坏血酸在 EC 细胞中的抗肿瘤作用和 LKB1 fl/fl p53 fl/fl 小鼠的肿瘤生长。通过 shRNA 敲低 PTEN 降低了 EC 细胞对抗坏血酸的抗肿瘤敏感性，而通过 Ipatasertib 抑制 AKT/mTOR 通路则显著增强了抗坏血酸在 EC 细胞中的抗肿瘤活性。与单独使用任一药物相比，抗坏血酸与紫杉醇联合使用可协同抑制 LKB1 fl/fl p53 fl/fl 小鼠中的肿瘤生长。总体而言，高剂量抗坏血酸部分通过 PTEN/AKT/mTOR 和细胞应激通路表现出抗肿瘤活性，并且在 EC 中与紫杉醇联合使用时这些抗肿瘤作用增强。抗坏血酸与紫杉醇联合使用的临床试验值得在 EC 患者中进一步研究。
通过抑制 ATPase RUVBL1/2 靶向胰腺癌中的 MYC 效应功能
摘要 目的 标志性致癌基因 MYC 驱动大多数肿瘤的进展，但小分子药物直接抑制 MYC 尚未进入临床试验。MYC 是一种依赖几种结合伙伴发挥作用的转录因子。因此，我们探索了通过胰腺导管腺癌 (PDAC) 中的相互作用组靶向 MYC 的可能性。 设计 为了在所有 MYC 结合伙伴中找出最合适的靶点，我们构建了一个靶向 shRNA 文库，并在培养的 PDAC 细胞和小鼠肿瘤中进行筛选。 结果 出乎意料的是，发现许多 MYC 结合伙伴对培养的 PDAC 细胞很重要，但在体内却不是必需的。然而，有些对自然环境中的肿瘤也是必不可少的，其中 ATPases RUVBL1 和 RUVBL2 排名第一。生长素-降解元系统降解 RUVBL1 导致培养的 PDAC 细胞停滞（而非未转化细胞），并导致小鼠的肿瘤完全消退，而此前免疫细胞浸润。从机制上讲，RUVBL1 是 MYC 建立致癌和免疫逃避基因表达所必需的，从而确定 RUVBL1/2 复合物是 MYC 驱动癌症中可用药的弱点。结论我们研究的一个含义是 PDAC 细胞依赖性受环境的强烈影响，因此应在体外和体内进行基因筛选。此外，生长素-降解元系统可应用于 PDAC 模型，从而允许在活体小鼠中进行靶标验证。最后，通过揭示 RUVBL1/2 复合物的核功能，我们的研究提出了一种使胰腺癌可能对免疫疗法敏感的药物策略。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂 Largazole 抑制 SP1 和 BRD4，使一组超级增强子失活，并导致有丝分裂染色体错位
组蛋白去乙酰化酶抑制剂已被研究作为癌症和其他疾病的潜在治疗剂。已知 HDI 可促进组蛋白乙酰化，从而导致开放染色质构象并通常增加基因表达。在之前的研究中，我们报告了一组基因，特别是那些由超级增强子调控的基因，可以被 HDAC 抑制剂拉格唑抑制。为了阐明拉格唑抑制基因的分子机制，我们进行了转座酶可及染色质测序、ChIP-seq 和 RNA-seq 研究。我们的研究结果表明，虽然拉格唑治疗通常会增强染色质的可及性，但它会选择性地降低一组超级增强子区域的可及性。这些基因组区域在拉格唑存在下表现出最显著的变化，富含 SP1、BRD4、CTCF 和 YY1 的转录因子结合基序。 ChIP-seq 分析证实 BRD4 和 SP1 在染色质上各自位点的结合减少，特别是在调节基因（如 ID1、c-Myc 和 MCM）的超级增强子上。拉格唑通过抑制 DNA 复制、RNA 加工和细胞周期进程发挥作用，部分是通过抑制 SP1 表达来实现的。shRNA 消耗 SP1 可模拟拉格唑的几种关键生物学效应并增加细胞对该药物的敏感性。针对细胞周期调控，我们证明拉格唑通过干扰中期染色体排列来破坏 G/M 转换，这种表型在 SP1 消耗时也观察到。我们的结果表明，拉格唑通过抑制超级增强子上的 BRD4 和 SP1 发挥其生长抑制作用，导致细胞抑制反应和有丝分裂功能障碍。
MYPT1 的下调通过靶向 Hippo 通路并增加干细胞特性来增加卵巢癌的肿瘤耐药性
背景：卵巢癌是最常见和最恶性的癌症之一，部分原因是其诊断晚、复发率高。化疗耐药与不良预后有关，并被认为与癌症干细胞 (CSC) 库有关。因此，阐明介导治疗耐药的分子机制对于找到治疗耐药性肿瘤的新靶点至关重要。方法：卵巢癌细胞系中的 MYPT1 shRNA 消耗、miRNA 过表达、RT-qPCR 分析、患者肿瘤样本、细胞系和肿瘤球衍生的异种移植、体外和体内治疗、公共转录组患者数据库和内部患者队列中卵巢肿瘤数据的分析。结果：我们发现编码肌球蛋白磷酸酶靶亚基 1 的 MYPT1 (PPP1R12A) 在卵巢肿瘤中下调，导致生存率降低和肿瘤发生率增加，以及对铂类疗法的耐药性。类似地，靶向 MYPT1 的 miR-30b 过表达会增强卵巢肿瘤细胞的 CSC 样特性，并与 Hippo 通路的激活有关。抑制 Hippo 通路转录辅激活因子 YAP 可在体内和体外抑制由低 MYPT1 表达或 miR-30b 过表达引起的对铂类疗法的耐药性。结论：我们的工作揭示了卵巢肿瘤对化疗的耐药性与 MYPT1 下调后 Hippo 通路靶基因激活导致的 CSC 池增加之间的功能性联系。顺铂和 YAP 抑制剂联合治疗可抑制 MYPT1 诱导的耐药性，表明可在 MYPT1 表达低、可能对铂类疗法产生耐药性的患者中使用这种治疗方法。
通过抑制 ATPase RUVBL1/2 靶向胰腺癌中的 MYC 效应功能
摘要 目的 标志性致癌基因 MYC 驱动大多数肿瘤的进展，但小分子药物直接抑制 MYC 尚未进入临床试验。MYC 是一种依赖几种结合伙伴发挥作用的转录因子。因此，我们探索了通过胰腺导管腺癌 (PDAC) 中的相互作用组靶向 MYC 的可能性。 设计 为了在所有 MYC 结合伙伴中找出最合适的靶点，我们构建了一个靶向 shRNA 文库，并在培养的 PDAC 细胞和小鼠肿瘤中进行筛选。 结果 出乎意料的是，发现许多 MYC 结合伙伴对培养的 PDAC 细胞很重要，但在体内却不是必需的。然而，有些对自然环境中的肿瘤也是必不可少的，其中 ATPases RUVBL1 和 RUVBL2 排名第一。生长素-降解元系统降解 RUVBL1 导致培养的 PDAC 细胞停滞（而非未转化细胞），并导致小鼠的肿瘤完全消退，而此前免疫细胞浸润。从机制上讲，RUVBL1 是 MYC 建立致癌和免疫逃避基因表达所必需的，从而确定 RUVBL1/2 复合物是 MYC 驱动癌症中可用药的弱点。结论我们研究的一个含义是 PDAC 细胞依赖性受环境的强烈影响，因此应在体外和体内进行基因筛选。此外，生长素-降解元系统可应用于 PDAC 模型，从而允许在活体小鼠中进行靶标验证。最后，通过揭示 RUVBL1/2 复合物的核功能，我们的研究提出了一种使胰腺癌可能对免疫疗法敏感的药物策略。
利用 5'UTR 二级结构精确滴定救援蛋白翻译的单转录本敲低-替换策略
基因治疗的一个主要目标是用功能性基因替换有缺陷的基因。一个重大的障碍是，蛋白质的表达不足或过度表达可能像编码突变一样容易导致疾病。目前显然需要将经过实验验证的基因治疗策略转化为临床应用。为了解决这个问题，我们开发了一个模块化的单转基因表达系统，用于用生理表达的变体替换目标基因。为了实现这一点，我们首先设计了一系列 5'UTR“衰减器”序列，这些序列可以预测地减少配对基因的翻译。这些序列通过允许控制高表达、普遍存在的启动子的翻译，提供了广泛的通用用途。重要的是，我们证明这允许通过在单个转录本上将 microRNA 适应的 shRNA 与其各自的替代基因配对来实现全新的敲除和救援应用。这种矫正方法的一个值得注意的候选对象是退行性且致命的运动神经元疾病 ALS。很大一部分非特发性 ALS 病例是由 SOD1 基因的各种突变引起的，随着治疗 ALS 的临床试验的启动，重要的是要考虑到功能丧失机制对其病理的影响与任何其他因素一样大。作为治疗由异质突变引起的单基因疾病的通用方法，我们通过改变衰减剂的强度证明了对稳定细胞系中 SOD1 替换的完全和可预测的控制。
青蒿琥酯影响病毒阳性默克尔细胞癌的 T 抗原表达和存活率
摘要：默克尔细胞癌 (MCC) 是一种罕见且极具侵袭性的皮肤癌，常见病因是病毒。事实上，大约 80% 的病例与默克尔细胞多瘤病毒 (MCPyV) 有关；病毒 T 抗原的表达对于病毒阳性肿瘤细胞的生长至关重要。据报道，用于治疗疟疾的药物青蒿琥酯具有额外的抗肿瘤和抗病毒活性，我们试图在临床前评估青蒿琥酯对 MCC 的影响。我们发现青蒿琥酯在体外抑制了 MCPyV 阳性 MCC 细胞的生长和存活。这种影响伴随着大 T 抗原 (LT) 表达的降低。但值得注意的是，它比 shRNA 介导的 LT 表达下调更有效。有趣的是，在一种 MCC 细胞系 (WaGa) 中，T 抗原敲低使细胞对青蒿琥酯的敏感性降低，而对于其他两种 MCC 细胞系，我们无法证实这种关系。从机制上讲，青蒿琥酯主要在 MCPyV 阳性 MCC 细胞中诱导铁死亡，因为已知的铁死亡抑制剂如 DFO、BAF-A1、Fer-1 和 β-巯基乙醇可减少青蒿琥酯诱导的死亡。最后，在异种移植小鼠中应用青蒿琥酯表明，已建立的 MCC 肿瘤的生长可以在体内得到显著抑制。总之，我们的结果揭示了已获批准且通常耐受性良好的抗疟疾化合物青蒿琥酯对 MCPyV 阳性 MCC 细胞具有高度的抗增殖作用，表明其可用于 MCC 治疗。
B细胞恶性肿瘤的正向和反向遗传学 硝酸盐对高血压患者口服微生物组和唾液生物标志物的影响 潮汐流与风能：与混合系统中短期存储结合使用的循环功率的值
癌症基因组测序已鉴定出数十个突变，在淋巴作用和白血病发生中起作用。验证负责B细胞肿瘤的驱动突变的验证是值得研究的突变体积以及由B细胞发育不同阶段引起的多个突变的复杂方式而变得复杂的。小鼠的正向和反向遗传策略可以提供对人类驱动基因的互补验证，在某些情况下，这些模型的人肿瘤的比较基因组学指导了对人类恶性肿瘤中新驱动因素的鉴定。我们回顾了使用插入诱变，化学诱变和外显子组测序进行的前向遗传筛选的集合，并讨论如何使用人类肿瘤基因组识别插入性诱变筛查中插入性诱变筛查中的高渗透覆盖范围如何鉴定在无法使用人类肿瘤基因组的速度下进行合作的突变。我们还比较了一组从PAX5突变小鼠中进行的独立进行的筛选，该筛网会在人类急性淋巴细胞性白血病（ALL）中观察到的一组常见突变集合。我们还讨论了使用CRISPR-CAS，ORF和SHRNA的反向遗传模型和筛选，以提供高吞吐量的体内证据，以实现致癌功能，重点是使用经体培养细胞的收养转移模型。最后，我们总结了在体内环境中提供候选基因的时间调节的小鼠模型，以证明其编码蛋白作为治疗靶标的潜力。
5-脂氧合酶的药理学和遗传靶向阻断 c-Myc 致癌信号并通过细胞凋亡杀死恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞
前列腺癌的大部分发病率和死亡率都是由去势抵抗性前列腺癌 (CRPC) 引起的，这种癌症在抗雄激素治疗后必然会发展。FDA 批准的恩杂鲁胺通常用于治疗 CRPC，其作用是阻断雄激素受体功能。然而，即使在最初反应良好之后，恩杂鲁胺耐药性前列腺癌 (ERPC) 也会发展，最终导致广泛转移。ERPC 的治疗极其困难，因为现有的治疗方案无法有效杀死和消除 ERPC 细胞。虽然恩杂鲁胺耐药性背后的机制尚不清楚，但已发现 c-Myc 的过度激活是一种常见事件，在 ERPC 表型的维持和发展中起着重要作用。然而，直接靶向 c-Myc 会带来特殊问题，因为它具有非酶性质，并且非癌细胞也需要一定量的 c-Myc 活性。因此，c-Myc 已成为一个难以捉摸的靶点，需要通过新型药物和策略以癌症特异性的方式进行管理。我们研究了 5-脂氧合酶 (5-Lox) 的药理学和遗传抑制对恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞的细胞增殖、凋亡和侵袭潜力的影响。通过 DNA 结合、荧光素酶测定和 c-Myc 靶基因的表达分析了 c-Myc 的转录活性。我们发现 5-Lox 调节恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞中的 c-Myc 信号传导，而 Quiflapon/MK591 或 shRNA 对 5-Lox 的抑制会中断致癌 c-Myc 信号传导并通过触发 caspase 介导的细胞凋亡杀死 ERPC 细胞。有趣的是，在相同的实验条件下，MK591 不会影响正常的非癌细胞。我们的研究结果表明，抑制 5-Lox 可能成为一种有前途的新方法，有效杀死 ERPC 细胞而不伤害正常细胞，并表明通过使用合适的 5-Lox 抑制剂杀死和消除 ERPC 细胞，可能开发出一种长期治愈前列腺癌的疗法。