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聚合酶θ缺陷型拟南芥的基因靶向
几十年来，农杆菌介导的转化一直是生成转基因植物的首选工具。在此过程中，携带转基因的 T-DNA 从细菌转移到植物细胞中，在那里它通过聚合酶θ (Pol h ) 介导的末端连接 (TMEJ) 随机整合到基因组中。通过同源重组 (HR) 将 T-DNA 靶向到特定基因组位点也是可能的，但此类基因靶向 (GT) 事件发生的频率很低，并且几乎总是伴随着随机整合事件。另一个复杂因素是，T-DNA 和目标位点重组的产物可能不仅映射到目标位点 (真正的 GT)，还可能映射到基因组中的随机位置 (异位 GT)。在本研究中，我们通过使用突变了 TEBICHI 基因（该基因编码 Pol h ）的拟南芥，研究了 TMEJ 功能如何影响植物中 GT 的生物学。在 TMEJ 功能强大的植物中，我们主要发现 GT 事件伴随着随机的 T-DNA 整合，而在 teb 突变体背景下获得的 GT 事件缺乏额外的 T-DNA 拷贝，证实了 Pol h 在 T-DNA 整合中的重要作用。Pol h 缺乏也会阻止异位 GT 事件，这表明导致此结果的事件序列需要 TMEJ。我们的研究结果提供了可用于制定在农作物中获得高质量 GT 事件的策略的见解。
农作物的非转基因基因组编辑方法
基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑技术有可能加快大规模作物育种计划。然而，坚硬的细胞壁限制了 CRISPR/Cas 成分进入植物细胞，从而降低了基因组编辑效率。已建立的方法，例如农杆菌介导或基因枪转化，已用于将含有 CRISPR 成分的基因盒整合到植物基因组中。这些方法虽然有效，但也存在几个问题，包括 1) 转化过程需要费力且耗时的组织培养和再生步骤；2) 许多作物物种和优良品种难以转化；3) 在无性繁殖或高度杂合的作物（如菠萝）中，转基因的分离要么困难要么不可能；4) 生产转基因第一代可能引起公众争议和繁重的政府监管。无转基因基因组编辑技术的发展可以解决许多与转基因方法相关的问题。无转基因基因组编辑已通过递送预组装的 CRISPR/Cas 核糖核蛋白实现，尽管其应用有限。使用病毒载体递送 CRISPR/Cas 成分最近已成为一种强有力的替代方法，但需要进一步探索。在这篇综述中，我们讨论了无转基因基因组编辑方法的不同策略、原理、应用和未来方向。
yem agar
yem琼脂打算使用yem琼脂被广泛用于农杆菌物种和其他土壤微生物的培养。摘要农杆菌是革兰氏阴性细菌的属。农业属是非常异质的。农杆菌以其在自身和植物之间转移DNA的能力而闻名。农杆菌Tumefaciens是一种无处不在的土壤，负责造成冠状病的病原体，影响了许多较高的植物。yem琼脂还用于培养共生氮固定的微生物（如根瘤菌），使其适合于生产豆类接种剂。YEM琼脂原理，其中含有甘露醇作为碳源和酵母提取物，作为农杆菌的氮和生长因子的来源。它也可以固定氧化 - 在有利于根瘤菌的范围内培养基的降低潜力，并在呼吸过程中充当氢供体。甘露醇是可发酵的糖酒精来源。镁提供了对农杆菌生长必不可少的阳离子。配方 *成分G/L酵母提取物1.0甘露醇10.0二磷酸氢磷酸盐0.5硫酸镁0.2氯化钠0.1琼脂0.1琼脂15.0最终pH（在25°C下）7.0±0.2 *调整为适合性能参数。储存和稳定存储在紧密闭合的容器和2°C-8°C下制备的培养基中脱水的培养基脱水。避免冷冻和过热。在标签上到期日之前使用。打开后，保持粉末状培养基闭合以避免补水。样品收集和处理确保所有样品都正确标记。按照确定的准则遵循适当的技术来处理样品。某些样品可能需要特殊处理，例如立即制冷或免受光的保护，遵循标准程序。样品必须在允许的持续时间内存储和测试。使用后，必须在丢弃前高压灭菌对受污染的材料进行消毒。指示
高粱高粱醇溶蛋白基因定点诱变的双元载体构建
高粱 (Sorghum bicolor (L.) Moench) 是世界主要的农业生产谷物作物之一，在干旱地区具有特殊重要性。然而，与其他谷物不同，高粱的营养价值较低，这是由于其种子储存蛋白 (kafirins) 对蛋白酶消化具有抗性等原因造成的。提高高粱营养价值的有效方法之一是获得部分或完全抑制 kafirins 合成或改变 kafirins 氨基酸组成的突变体。利用基因组编辑可以通过在 α- 和 γ-kafirin 基因的核苷酸序列中引入突变来解决此问题。在本研究中，选择了基因组靶基序 (23 bp 序列) 以将突变引入高粱的 α- 和 γ-KAFIRIN 基因。使用在线工具 CRISPROR 和 CHOPCHOP 进行 gRNA 的设计。为 α-KAFIRIN (k1C5) 和 γ-KAFIRIN (gKAF1) 基因选择了两个最合适的靶标。在 BsaI (Eco31I) 位点将相应序列插入通用载体 pSH121。通过 DNA 测序验证克隆过程。使用 SfiI 限制位点将所得构建体亚克隆到兼容的二元载体 B479p7oUZm-LH 中。通过使用 MluI 和 SfiI 切割位点的限制分析确认二元载体的正确组装。通过电穿孔将创建的四个载体 (1C - 4C) 转移到农杆菌菌株 AGL0 中。目前，该载体系列用于使用未成熟胚外植体对高粱进行稳定转化。
在番茄中应用CRISPR/CAS9介导的基因编辑
crispr-/cas9介导的基因编辑已在包括番茄在内的许多食品作物中证明。番茄（Solanum lycopersicum）既是重要的粮食作物，又是一种模型植物物种，已广泛用于研究基因功能，尤其是与水果生物学有关的植物。这种双重性在目的中与随时可用的资源（突变种群，基因组序列，转化方法）相结合，使番茄成为基因编辑的理想候选者。我们实验室通常使用的CRISPR/CAS9系统已应用于各种番茄基因型和野生物种solanum pimpinellium。矢量系统基于金门克隆技术。盒，该基因既赋予对卡纳米霉素的抗性，Kanamycin是由CAMV 35S启动子驱动的人类密码子驱动的Cas9，并在控制拟南芥U6 Polymerase促进剂的控制下引导RNA（GRNA）是组装成T-Dna的casss cass9。通常，我们设计了每个基因靶标的两个GRNA的CRISPR/CAS9构建体。但是，我们已经成功地包括多达八个grnas，以同时针对多个基因和区域。将CRISPR-/CAS9设计的构建体引入番茄中是通过基于基于NPTII基因的存在的培养基的培养基的培养基感染的转化方法来实现的。本章详细介绍了CRISPR/CAS9构建体和基因型分析（基于PCR的扩增子测序和T7核酸内切酶）的方法。
yem肉汤
yem肉汤预期用roth肉汤广泛用于农业杆菌和其他土壤微生物的培养。摘要农杆菌是革兰氏阴性细菌的属。农业属是非常异质的。农杆菌以其在自身和植物之间转移DNA的能力而闻名。农杆菌Tumefaciens是一种无处不在的土壤，负责造成冠状病的病原体，影响了许多较高的植物。yem琼脂还用于培养共生氮固定的微生物（如根瘤菌），使其适合于生产豆类接种剂。原理YEM肉汤，其中含有甘露醇作为碳源和酵母提取物，作为农杆菌的氮和生长因子的来源。它也可以固定氧化 - 在有利于根瘤菌的范围内培养基的降低潜力，并在呼吸过程中充当氢供体。甘露醇是可发酵的糖酒精来源。镁提供了对农杆菌生长必不可少的阳离子。配方 *成分G/L酵母提取物1.0甘露醇10.0磷酸磷酸二硫酸镁0.5硫酸镁0.2氯化钠0.1最终pH（在25°C下）7.0±0.2 *调整了以适应性能参数。储存和稳定存储在紧密闭合的容器和2°C-8°C下制备的培养基中脱水的培养基脱水。避免冷冻和过热。在标签上到期日之前使用。打开后，保持粉末状培养基闭合以避免补水。样品收集和处理确保所有样品都正确标记。指示按照确定的准则遵循适当的技术来处理样品。某些样品可能需要特殊处理，例如立即制冷或免受光的保护，遵循标准程序。样品必须在允许的持续时间内存储和测试。使用后，必须在丢弃前高压灭菌对受污染的材料进行消毒。
转基因杨树抵抗森林害虫和病原体侵袭的概述
森林是巨大陆地生态系统和水生生物多样性的潜在栖息地，在生态保护和气候调节中发挥着重要作用。人类对森林的压力导致森林消失、破碎化和退化。在气候变化制度下，可持续的森林保护方法的要求是重中之重。在林木中，杨树 (Populus L.) 在全球林业中引起了关注，因为它是改善城市景观质量和数量的有前途的材料。这些植物提供的木材可用作造纸业的原材料和潜在的生物燃料来源。然而，一些生物胁迫，如害虫和病原体的侵袭，严重影响杨树的生产和生产力。由于杨树的生命周期长，缺乏具有抗性基因的合适供体，通过传统的树木育种方法对杨树的改良受到限制。由于杨树具有高效的遗传转化能力，它已被用作研究基因功能的模型植物。本综述将全面概述杨树受到的害虫和病原体的侵袭，重点介绍其感染机制、传播途径和控制策略。此外，还将研究最广泛使用的遗传转化方法（基因枪介导、农杆菌介导、原生质体转化、micro-RNA 介导和 micro-RNA 成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关 (CRISPR-Cas) 系统方法和 RNA 干扰），以提高杨树对害虫和病原体的耐受性。此外，还将深入探讨分子生物学工具的前景、挑战和最新进展，以及它们在遗传转化以提高杨树抗虫害能力的安全应用。最后，讨论了通过各种基因工程技术开发的抗性转基因杨树的再生。
一种改良的农杆菌介导的针对两种卵菌病原体的转化方法
卵菌是一类丝状微生物，其中包括对粮食安全和自然生态系统的最大威胁之一。然而，这些生物的致病机制和发育的大部分分子基础仍有待了解，这主要是由于缺乏有效的基因操作方法。在本研究中，我们开发了针对两种重要的卵菌物种 Phytophthora infestans 和 Plasmopara viticola 的改良转化方法，这两种物种给农业生产带来了毁灭性的损害。作为研究的一部分，我们通过在农杆菌中原核表达 AtVIP1（VirE2 相互作用蛋白 1）建立了一种改良的农杆菌介导转化 (AMT) 方法，AtVIP1 是拟南芥的一个 bZIP 基因，是 AMT 所必需的，但在卵菌基因组中不存在。使用新方法，我们提高了两种 P . infestans 菌株的转化效率。我们进一步使用改良的 AMT 方法获得了 P . viticola 的阳性 GFP 转化子。通过将此方法与 CRISPR/Cas12a 基因组编辑系统相结合，我们成功进行定点诱变，并在两个马铃薯致病疫霉基因中产生了功能丧失的突变。我们编辑了一个 MADS-box 转录因子编码基因，发现 MADS-box 的纯合突变导致孢子形成不良和毒力显著降低。同时，我们针对马铃薯致病疫霉中单拷贝无毒力效应基因 Avr8 进行了定点突变，编辑后的转化子对携带同源抗性基因 R8 的马铃薯具有毒性，这表明 Avr8 的缺失导致病原体成功逃避宿主的免疫反应。总之，本研究报告了一种改进的遗传转化和基因组编辑系统，为加速卵菌和其他微生物的分子遗传学研究提供了一种潜在的工具。
CRISPR Cas9 编辑多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 ...
硬度是草莓最重要的果实品质性状之一。这种软果实采后保质期在很大程度上受到硬度损失的限制，而细胞壁的分解起着重要作用。先前的研究表明，多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 在草莓软化过程中对果胶的重塑起着关键作用。在本研究中，使用农杆菌传递的 CRISPR/Cas9 系统生成了 FaPG1 敲除草莓植株。获得了 10 个独立品系 cv.“Chandler”，经 PCR 扩增和 T7 内切酶测定确定所有品系均已成功编辑。使用靶向深度测序分析了定向诱变插入和删除率。编辑序列的百分比从 47% 到几乎 100% 不等，其中 7 个选定品系的编辑序列百分比高于 95%。表型分析表明，在所分析的 8 个品系中，有 7 个品系产生的果实明显比对照更坚硬，硬度增加了 33% 到 70%。 FaPG1 编辑程度与果实硬度增加呈正相关。其他果实品质特征（如颜色、可溶性固体、可滴定酸度或花青素含量）的变化很小。编辑后的果实在采后软化率降低，蒸腾水分损失减少，受灰葡萄孢菌接种的损害较小。对四个潜在脱靶位点的分析未发现突变事件。总之，使用 CRISPR/Cas9 系统编辑 FaPG1 基因是提高草莓果实硬度和保质期的有效方法。