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在微尺度液滴中培养多能干细胞可调节芯片上类器官的分化和组织模式
多能干细胞 (PSC) 的分化及其向类器官的自组织受到细胞间相互作用的影响，这些相互作用由接触和分泌分子介导。由于限制和小的培养体积，这些相互作用在微流体液滴中得到增强。然而，尚未对液滴内 PSC 的培养及其微环境的影响进行全面研究。在本研究中，我们提出了一个液滴平台，用于在细胞定型的各个阶段对 PSC 进行 3D 培养。我们展示了 PSC 分化为三个胚层以及在液滴内形成类器官的可行性。我们的研究结果表明，在密闭空间中培养 PSC 可以调节细胞命运决定，通过依次诱导不同分化细胞群的生长和迁移来促进类原肠胚中的组织模式形成，并促进心脏类器官的自组织。这种技术方法为体外调节组织自模式形成的内在因素提供了独特的见解。
amotl2在多能性和人类干细胞分化中的作用
在过去的几年中，对发育过程的转录调节进行了广泛的研究，但仍然存在有关机械和代谢线索的知识差距，并且基本的形态事件伴随着人类多能干细胞（HPSC）差异。在寻找此类信号时，我首先从胚胎天14.5天（E14.5）和16.5（E16.5）的发育中的鼠pancreata的单细胞RNA-sequect（SCRNA-Seq）数据中识别出Amotl2基因。有趣的是，尽管有保守的规范标记，但这些时间点的内分泌祖细胞（EP）种群在其转录组中差异很大，E16.5 EPS更容易形成胰腺β细胞，而E14.5 EPS优先形成α-Cells。amotl2在E16.5 EPS的亚型中特异性表达，该EPS反映了EPS与上皮绳索的分层，这是一个可能影响内分泌细胞命运的事件。
DNA甲基化在退出幼稚多能性过程中塑造了多梳景观
在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和多梳抑制复合物 2 (PRC2) 沉积的组蛋白 3 赖氨酸 27 三甲基化 (H3K27me3) 在富含 CpG 的区域通常是互斥的。当小鼠胚胎干细胞退出幼稚多能状态时，5mC 大量增加，同时 H3K27me3 被限制在无 5mC 的富含 CpG 的区域。为了正式评估 5mC 如何塑造 H3K27me3 景观，我们在存在和不存在 DNA 甲基化机制的情况下分析了幼稚细胞和分化细胞的表观基因组。令人惊讶的是，我们发现 5mC 积累并不是限制大多数 H3K27me3 域所必需的。相反，这种不依赖 5mC 的 H3K27me3 限制是由 PRC2 拮抗剂 Ezhip（编码 EZH 抑制蛋白）的异常表达介导的。在 5mC 似乎真正取代 H3K27me3 的区域子集中，我们确定了 163 个候选基因，这些基因似乎需要 5mC 沉积和/或 H3K27me3 耗竭才能在分化细胞中激活。使用定点表观基因组编辑直接调节 5mC 水平，我们证明 5mC 沉积足以拮抗 H3K27me3 沉积并赋予单个候选基因基因激活。总之，我们系统地测量了重现早期胚胎动力学的系统中 5mC 和 H3K27me3 之间的拮抗相互作用。我们的结果表明 H3K27me3 抑制直接和间接地依赖于 5mC。我们的研究还表明 5mC 在基因激活中发挥着非规范作用，这不仅对正常发育很重要，而且对癌症进展也很重要，因为致癌细胞经常表现出 5mC 与 H3K27me3 的动态替换，反之亦然。
丝氨酸整合酶 BxbI 高度增强人类多能干细胞中的转基因整合
现代基因组工程技术已经能够以有针对性的方式对哺乳动物细胞进行改造，从单核苷酸改变到插入更大的转基因有效载荷。然而，利用靶向核酸酶（如 CRISPR/Cas9）的方法依赖于细胞 DNA 修复机制进行同源定向修复介导的整合，需要产生暴露的 DNA 双链断裂 (DSB)，在插入较大的 DNA 货物时效率极低，并且经常导致不必要的编辑结果 1–4 。人类多能干细胞 (hPSC) 通过整合治疗有效载荷基因并分化为所需的细胞类型，为细胞治疗应用提供了巨大的潜力 5–8 然而，hPSC 特别难以工程化，因为它们易受 p53 介导的 DNA 损伤反应诱导的细胞凋亡的影响 9,10 。丝氨酸整合酶（例如 BxbI）不依赖于细胞机制并且不被认为产生暴露的 DSB，因此最近它们已被用于成功地将大有效载荷整合到 hPSC 中，既直接整合到预先设计的着陆垫中 11-13 ，也与 Cas9 介导的靶向结合使用 14-16 。通过整合选择标记 11,17,18 ，可以生成 100％ 工程化的 hPSC 群体，但是如果没有选择，报告的靶向效率仍然非常低，通常低于 1％ 13,18 。许多应用将受益于 hPSC 中大有效载荷的更高整合效率，因此一直在努力开发更有效的 BxbI 蛋白，但是到目前为止，这些努力仅导致 hPSC 靶向效率达到 3.8％ 16,19 。在本研究中，我们着手测试是否可以通过优化核苷酸序列、递送方法和抑制 p53 通路来提高 BxbI 整合酶在 hPSC 中的靶向效率。
STRAIGHT-IN Dual：一种将 DNA 有效载荷和基因回路以双重、单拷贝方式整合到人类诱导性多能干细胞中的平台
将 DNA 有效载荷靶向人类 (h)iPSC 涉及多个耗时、低效的步骤，每个构建体都必须重复这些步骤。在这里，我们介绍了 STRAIGHT-IN Dual，它能够在一周内以 100% 的效率同时、等位基因特异性、单拷贝整合两个 DNA 有效载荷。值得注意的是，STRAIGHT-IN Dual 利用 STRAIGHT-IN 平台实现几乎无疤痕的货物整合，促进组件回收以进行后续的细胞修饰。使用 STRAIGHT-IN Dual，我们研究了启动子选择和基因语法如何影响转基因沉默，并展示了这些设计特征对 hiPSC 向神经元正向编程的影响。此外，我们设计了一种格拉瑞韦诱导的 synZiFTR 系统来补充广泛使用的四环素诱导系统，提供转录因子和功能报告基因的独立、可调和时间控制的表达。 STRAIGHT-IN Dual 生成同质基因工程 hiPSC 群体的空前效率和速度代表了合成生物学在干细胞应用领域的重大进步，并为精准细胞工程开辟了机会。
使用人多能干细胞衍生的视网膜片的手术成功闭合
Akiba R，Masuda T，Yokota S，Yonemura S，Nishida K，Takahashi M，Kurimoto Y，MandaiM。干细胞报告。2024 doi：10.1016/j.stemcr.2024.09.002。※epub在印刷前。pmid：39366379。
一个用于工程性低下多能干细胞的单步过程
平台，它可以通过DNA结合CAS和DNA修饰脱氨酶组成的基础编辑器的模块化组件，该基础编辑器通过在序列靶向指导指南RNA（GRNA）中编码的适体相关的Deaminase组件组成。由于适体依赖于脱氨酶成分靶向DNA序列，PIN点平台唯一地允许多对单个Cas Nickase组件进行多用作用于同时多发性基础编辑和靶向的转基因敲入。编码由大鼠APOBEC1和SPCAS9 NICKASE组成的PIN点基本编辑器的mRNA瞬时传递与合成适性剂编码的GRNA结合使用，可实现耐用的靶蛋白敲除，并显着提高了细胞生存能力，编辑效率，以及与CRISPR-CasS9相比，基因组的编辑效率和基因组完整性均与CRISPR-CasS9相比。为了演示同种异体PSC工程的PIN点平台的实用性，我们使用自动化的克隆跟踪和拾取工作流进行了一系列基因型，生成了一组克隆性低下IPSC线。通过多重碱基编辑和同时进行靶向转基因整合的碱基编辑生成的低免疫原性IPSC系列保留了多能性，并在区别为治疗细胞产物时表现出预期的人白细胞抗原（HLA）表型。因此，PIN点平台代表了一种安全有效的解决方案，可以通过与下游自动化兼容的新型单步过程同时执行多个基因组工程操作，从而提供了极大地简化同种异体IPSC衍生细胞疗法的开发的机会。
来自人类诱导性多能干细胞的 TREM2 修饰小胶质细胞中 TREM2 相关衔接蛋白 DAP12 的差异表达
人类小胶质细胞是必需的免疫细胞，可通过调查和协助清理周围环境来帮助调节中枢神经系统 (CNS) 的稳态微环境。在阿尔茨海默病 (AD) 中，患者的神经元周围 β-淀粉样斑块增多，这被认为是由小胶质细胞功能障碍引起的。AD 的遗传风险因素包括 APOE4 等位基因和 TREM2 变异，但原代细胞和组织的可用性有限限制了进行全面研究以更好地了解遗传影响的能力。在此，我们建议使用由 TREM2 修饰的 iPSC 系产生的人类诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的小胶质细胞作为小胶质细胞的现成来源，用于研究与神经退行性疾病相关的机制。
测量人类多能干细胞衍生的神经器官的神经元活性，用于疾病建模和药物发现
神经器官是建模发育过程和疾病机制的宝贵工具。但是，器官结构的变异性和缺乏标准化协议可能会使它们用于功能分析的使用复杂化。此外，诸如不足的神经胶质支持和神经元发育所需的较长成熟时间之类的挑战使得衡量一致的器官活动和功能特征很难。在这里，我们提供了标准化的工作流，用于使用三个STEMDIFF™类器官分化试剂盒生成中脑，大脑和脊髓器官，然后在StemDiff™神经器官维护套件或Brainphys™Neuronal培养基中成熟。诱导与疾病相关的表型，并使用微电极阵列（MES）测量功能输出。我们的数据表明，使用STEMDIFF™器官分化试剂盒生成的神经器官在长期培养后在STEMDIFF™神经器官维持试剂盒或Brainphys™神经元介质中长期培养后表现出强大的神经活动，为神经元疾病建模和药物发现提供了可靠的平台。
使用人类诱导性多能干细胞衍生的多细胞心脏类器官模拟急性心肌梗死和心脏纤维化
心脏病涉及不可逆的心肌损伤，导致高发病率和死亡率。许多基于细胞的心脏体外模型已被提出作为非临床动物研究的补充方法。然而，大多数这些方法都难以准确复制成人心脏状况，例如心肌梗死和心室重塑病理。成人心脏内各种细胞类型（包括心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）之间的复杂相互作用增加了大多数心脏病的复杂性。因此，心脏病诱发的机制不能归因于单细胞类型。因此，使用多细胞模型对于创建临床相关的体外细胞模型至关重要。本研究重点是使用人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 生成自组织心脏类器官 (HO)。这些类器官由心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞组成，模仿人类心脏的细胞组成。通过各种技术确认了 HO 的多细胞组成，包括免疫组织化学、流式细胞术、q-PCR 和单细胞 RNA 测序。随后，在受控培养条件下对 HO 进行缺氧诱导的缺血和缺血-再灌注 (IR) 损伤。产生的表型类似于急性心肌梗死 (AMI)，其特征是心脏细胞死亡、生物标志物分泌、功能缺陷、钙离子处理改变和搏动特性改变。此外，受到 IR 的 HO 有效地表现出心脏纤维化，显示胶原沉积、钙离子处理中断和模拟心脏病的电生理异常。这些发现对于体内 3D 心脏和疾病建模的进步具有重要意义。这些疾病模型为研究心脏疾病的动物实验提供了一种有希望的替代方案，并且它们也可作为药物筛选的平台以确定潜在的治疗靶点。