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World File Search System工程化
一种工程化的 Cas12i 核酸酶，是动物和植物中有效的基因组编辑工具
VI 型 CRISPR-Cas 系统在基因组编辑方面越来越有吸引力。然而，该系统的天然核酸酶通常效率低下，限制了它们的应用。在这里，我们使用结构引导的合理设计和蛋白质工程来优化一种未表征的 Cas12i 核酸酶 Cas12i3。结果，我们开发了 Cas-SF01，这是一种 Cas12i3 变体，在哺乳动物细胞中表现出显著改善的基因编辑活性。与 SpCas9 和其他 Cas12 核酸酶相比，Cas-SF01 显示出相当或更优异的编辑性能。与天然 Cas12i3 相比，Cas-SF01 具有扩展的 PAM 范围，并能有效识别 NTTN 和非规范 NATN 和 TTVN PAM。此外，我们还发现了一种氨基酸替代物 D876R，它显著降低了脱靶效应，同时保持了较高的靶向活性，从而开发出了 Cas-SF01 HiFi（高保真 Cas-SF01）。最后，我们表明 Cas-SF01 在小鼠和植物中具有较高的基因编辑活性。我们的结果表明，Cas-SF01 可以作为一种强大的基因编辑平台，具有高效性和特异性，适用于各种生物体的基因组编辑应用。
具有高活性、高特异性和广泛 PAM 范围的工程化 xCas12i
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 6 月 17 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.06.15.496255 doi：bioRxiv 预印本
CRISPR-Cas9 工程化同源荧光素酶表达细胞系作为癌症研究的体外和体内模型
CRISPR-Cas9 系统为生物学基础研究和转化研究疾病模型的开发提供了强大的基因编辑工具。本研究的目的是利用包括 CRISPR-Cas9 和生物发光在内的先进技术来生成新的人类细胞系，用作癌症研究中的体外和体内模型。大约 50% 的黑色素瘤患者有 BRAF V600E 突变，并且通常在治疗几个月后对当前的 BRAF 抑制剂产生耐药性。KRAS G13D 是一种与对这些抑制剂的耐药性相关的获得性突变。在这项研究中，CRISPR-Cas9 用于将 KRAS G13D 点突变敲入 A375 恶性黑色素瘤细胞系，该细胞系也含有可靶向的 BRAF V600E 突变。由此产生的 KRAS G13D 突变同源系 A375 已在基因组、转录本和蛋白质生物功能水平上得到验证，在传统的 2D 和 3D 细胞培养中研究时，该突变系对 BRAF 抑制剂达拉非尼和维莫非尼表现出显著的抗性。基于上述体外模型，我们通过将稳定的荧光素酶报告基因引入同源 A375 和 KRAS G13D A375 细胞系，开发了用于活体动物生物发光成像的其他模型。对细胞内的相对和绝对生物发光信号进行了量化，发现发射 4.9 x 10 5 光子/细胞/秒（A375）和 3.5 x 10 5 光子/细胞/秒（KRAS G13D A375）。本研究采用皮下异种移植模型，并使用 Xenogen IVIS™ 成像系统量化体内活体生物发光信号，以将肿瘤生长与荧光素酶表达关联起来。A375-Luc2 和 KRAS G13D A375-Luc2 注射到裸鼠体内后均生长为皮下肿瘤，生物发光水平不断提高。此外，还开发了 5 对人类同源荧光素酶报告细胞系和 18 种人类和小鼠荧光素酶报告细胞系，用于研究各种癌症类型。总之，CRISPR-Cas9 技术和稳定的荧光素酶表达两种技术的结合可以生成同源荧光素酶表达细胞系，这些细胞系是阐明肿瘤发生机制和研究体外和体内药物反应的宝贵工具。
通过装载 Navitoclax 的工程化 H-铁蛋白纳米笼选择性靶向癌症相关成纤维细胞
1 生物医学和临床科学系“L. Sacco”，米兰大学，意大利米兰 20157； leopoldo.sitia@unimi.it （LS）; arianna.bonizzi@unimi.it （AB）; serena.mazzucchelli@unimi.it （SM）; raffaele.allevi@unimi.it （RA）; marta.sevieri@unimi.it （微软）; filippo.silva@unimi.it （FS）2 Maugeri 科学临床研究所 IRCCS，27100 帕维亚，意大利； sara.negri@icsmaugeri.it （SN）; cristina.sottani@icsmaugeri.it （CS）; elena.grignani@icsmaugeri.it（埃及）; carlo.morasso@icsmaugeri.it (CM) 3 米兰比可卡大学生物技术与生物科学系，意大利米兰 20126； maria.rizzuto@unimib.it （MAR）; davide.prosperi@unimib.it （DP）4 意大利米兰国立肿瘤研究所基金会 IRCCS 结直肠外科科，20133 米兰，意大利； luca.sorrentino@istitutotumori.mi.it * 通信地址：marta.truffi@icsmaugeri.it (MT); fabio.corsi@icsmaugeri.it（FC）;电话：+39-0382-592219（MT）； +39-0250-319850 (分机 19858) (FC)
文章 表位工程化人类造血干细胞可免受 CD123 靶向免疫疗法的影响
Romina Marone 1.2 * 、Emmanuelle Landmann 1.2 * 、Anna Devaux 1.2 * 、Rosalba Lepore 1,2,3,4 * 、Denis Seyres 1.2 、Jessica Zuin 1.2 、Thomas Burgold 1.2 、Corinne Engdahl 1.2 、Giuseppina Capoferri 1.2 、Alessandro Dell ' Aglio 1.2 、Cl´ement Larrue 5 、Federico Simonetta 6.7 、Julia Rositzka 8.9 、Manuel Rhiel 8.9 、Geoffroy Andrieux 10 、Danielle N. Gallagher 11 Markus S. Schr oder 11，Am´elie Wiederkehr 4，Alessandro Sinopoli 4，Valentin Do Sacramento 3，Anna Haydn 4，Laura Garcia-Prat 3，Christopher 4，Christopher 4 ，14，Matthew Porteus 12，J´er ˆ OME Tamburini 7，Jacob E. Corn 11，Toni Cathomen 8,9，Tatjana I. Cornu 8,9，Stefanie Urlinger 3,4 ，以及 Lukas T. Jeker 1,2
工程化的环状 ADAR 募集 RNA 可提高体内和体外 RNA 编辑的效率和保真度
基因组编辑工具，如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶、CRISPR-Cas 系统和 CRISPR-Cas 衍生物（胞嘧啶和腺苷碱基编辑器），已广泛应用于基因组操作，并显示出它们的治疗潜力。除了基因组编辑技术之外，RNA 碱基编辑技术也得到了开发 1 。由于 RNA 编辑是可逆的、可调控的，并且不会导致基因组的永久性改变，因此它在治疗应用中可能具有一定的优势。对于腺苷的 RNA 编辑，作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 (ADAR) 家族的成员，如 ADAR1（异构体 p110 和 p150）和 ADAR2（参考文献 2、3），已被设计用于将腺苷 (A) 精确转化为肌苷 (I) 1 。 ADAR1/2 的催化底物是双链 RNA，ADAR1/2 的脱氨酶结构域负责 A 到 I 的 RNA 编辑 4、5。肌苷被识别为鸟苷 (G)，并在随后的细胞翻译过程中与胞苷 (C) 配对 3。为了实现靶向 RNA 编辑，ADAR 蛋白（或其脱氨酶结构域 ADAR DD）已与多种 RNA 靶向模块融合，例如 λ N 肽 6 – 8、SNAP 标签 9 – 13 和 Cas13 蛋白 14。此外，可以利用带有 R/G 基序的工程向导 RNA 与异位表达的 ADAR1 或 ADAR2 蛋白偶联来实现靶向 RNA 编辑 15 – 18。然而，外源编辑酶的异位表达与几个问题有关，包括基因组和/或 RNA 转录物的大量全局脱靶编辑 19 – 23 、免疫原性 24 – 27 、致癌性 28 – 30 和递送障碍 24 。 Stafforst 团队和我们自己报告的两种 RNA 编辑技术 RESTORE 31 和 LEAPER 32 利用内源性 ADAR 对 RNA 进行可编程编辑，而无需引入
工程化蛋氨酸腺苷转移酶级联用于活细胞中单个 DNA 甲基化的代谢标记
摘要：甲基化是一种广泛存在的天然修饰，具有多种调节和结构功能，由大量 S -腺苷-L -蛋氨酸 (AdoMet) 依赖性甲基转移酶 (MTases) 进行。AdoMet 辅因子由多聚体蛋氨酸腺苷转移酶 (MAT) 家族从 L -蛋氨酸 (Met) 和 ATP 产生。为了推进机制和功能研究，已经开发出重新利用 MAT 和 MTase 反应以接受来自相应前体的可转移基团的扩展版本的策略。在这里，我们使用结构引导的小鼠 MAT2A 工程，以便从合成的蛋氨酸类似物 S -(6-叠氮己-2-炔基)-L -同型半胱氨酸 (N 3 -Met) 生物催化生产扩展的 AdoMet 类似物 Ado-6-叠氮化物。三种工程化的 MAT2A 变体表现出对延伸类似物的催化能力，并且在没有和存在竞争性 Met 的情况下，都支持与 M. Taq I 和小鼠 DNMT1 的工程化变体在级联反应中进行 DNA 衍生化。然后，我们使用 CRISPR-Cas 基因组编辑将两种工程化变体作为 MAT2A-DNMT1 级联安装在小鼠胚胎干细胞中。所得细胞系在暴露于 N 3 -Met 且存在生理水平的 Met 时，保持正常的活力和 DNA 甲基化水平，并显示出 Dnmt1 依赖的 DNA 修饰和延伸叠氮化物标签。这首次展示了一种用于生物合成生产延伸 AdoMet 类似物的遗传稳定系统，该系统能够在活哺乳动物细胞中对 DNMT 特异性甲基化组进行轻度代谢标记。■ 简介
心脏纤维化抑制剂 CTPR390 可防止工程化人体结缔组织 2 胶原蛋白和成纤维细胞的结构和形态变化 3
心脏纤维化是心力衰竭的一个主要特征，目前尚无有效的治疗方法。40 使用三维人体模型和尖端生物技术来评估新 41 疗法提供了重大进展。CTPR390 是一种针对 Hsp90 的实验性抗纤维化抑制剂 42，已在动物模型中取得成功，但在人类 43 心脏模型中仍未得到探索。本研究评估了用 CTPR390 处理的心脏三维工程结缔组织 44 (ECT) 模型，重点关注细胞外基质和 45 成纤维细胞的变化。结果表明，CTPR390 可防止 TGFβ1 激活的 46 ECT 中的结构变化，保留组织周长、胶原纤维排列，同时降低 47 结构化区域的百分比和胶原结构化程度。此外，该治疗减少了张力下拉长成纤维细胞的细胞 48 面积，而没有张力的内部圆形细胞 49 则没有发生变化。成纤维细胞向张力区域的募集减少，显示出与对照 ECT 相似的 50 生物力学行为。这种治疗还降低了关键促纤维化标志物的基因和 51 蛋白质表达。首次采用先进的生物技术 52 检测施用 53 CTPR390 后组织纤维化减少的详细结构，代表了心脏 54 纤维化治疗临床应用的重大进步。 55
使用工程化的 CRISPR RNA 引导胞苷脱氨酶对结核分枝杆菌进行可编程碱基编辑
耐多药结核分枝杆菌 ( Mtb ) 感染严重危害全球人类健康，迫切需要新的治疗策略。高效的基因组编辑工具有助于识别参与细菌生理、发病机制和耐药机制的关键基因和途径，从而有助于开发耐药结核病的新疗法。在这里，我们报告了一个双质粒系统 MtbCBE，用于灭活基因并在 Mtb 中引入点突变。在该系统中，辅助质粒 pRecX-NucS E107A 表达 RecX 和 NucS E107A 以抑制 RecA 依赖性和 NucS 依赖性的 DNA 修复系统，碱基编辑质粒 pCBE 表达结合胞苷脱氨酶 APOBEC1、Cas9 切口酶 (nCas9) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合蛋白。这两个质粒共同实现了结核分枝杆菌基因组中所需位点处 G:C 到 A:T 碱基对的有效转换。碱基编辑系统的成功开发将有助于阐明结核分枝杆菌致病机理和耐药性的分子机制，并为开发其他微生物的碱基编辑工具提供重要启发。