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World File Search System库蚊
优化 CRISPR 工具和定点转基因以实现致倦库蚊的基因驱动发展
库蚊是多种人类和动物疾病的全球传播媒介，包括西尼罗河病毒、淋巴丝虫病和禽疟疾，对公共卫生、牲畜、伴侣动物和濒危鸟类构成持续威胁。虽然杀虫剂抗药性的不断增加威胁到库蚊的控制，但 CRISPR 基因组编辑工具的进步促进了替代遗传策略（如基因驱动系统）的发展，以对抗疾病媒介。然而，尽管基因驱动技术在其他蚊子中发展迅速，但在库蚊方面却进展缓慢。在这里，我们开发了库蚊特异性 Cas9/gRNA 表达工具包，并使用基于定点同源性的转基因来生成和验证库蚊 Cas9 表达系。我们表明，gRNA 支架变体可提高库蚊和果蝇的转基因效率，并提高果蝇的基因驱动性能。这些发现支持未来控制库蚊的技术开发，并为改进其他物种的这些工具提供宝贵的见解。
ReMOT 控制递送 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物以诱导疾病媒介蚊子淡色库蚊的种系诱变
淡色库蚊复合体分布广泛，导致蚊媒疾病在人类中的传播难以预防。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑是一种有效的技术，有可能解决日益严重的蚊媒疾病问题。本研究利用 ReMOT 控制技术在淡色库蚊中生产转基因蚊子。通过注射 60 只成年雌蚊建立了显微注射系统——需 14 µ l 注射混合物，使用≤1 µ l 的内体释放试剂（氯喹或皂苷）不会发生沉淀。在采血后 24 小时（卵黄发生高峰期）注射 P2C 增强型绿色荧光蛋白-Cas9（P2C-EGFP-Cas9）核糖核蛋白复合物进入卵巢的效率为 100%。利用此方法进行KMO敲除，我们发现当通过ReMOT Control将P2C-Cas9 RNP复合物注射到淡色库蚊成年血淋巴中时，卵巢中也能发生基因编辑。在氯喹组，筛选出的2,251只G 0 子代中，9只个体表现出白眼和马赛克眼表型。在皂苷组，筛选出的2,462只G 0 子代中，观察到8只突变个体。测序结果显示13 bp的缺失，进一步证实了发生基因编辑的事实。总之，ReMOT Control在淡色库蚊中的成功应用，不仅为该方法提供了基本参数（注射参数和注射时间），而且有利于蚊虫生物学和防治的研究。
扩展库蚊的 CRISPR 工具箱
摘要：基于 CRISPR − Cas9 的“基因驱动”技术已被提议作为一种新颖且有效的控制蚊子传播的人类疾病的方法。然而，需要比迄今为止展示的更复杂的设计以及构建它们的扩展分子工具箱以克服抗药性形成/进化和驱动空间/时间限制的问题。预见到这种需求，我们使用三种与疾病相关的库蚊细胞系（埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊）评估了 33 种系统发育不同的昆虫聚合酶 III 启动子的 sgRNA 转录活性。我们表明 U6 启动子可在具有一系列转录活性水平的物种中发挥作用，并且发现 7SK 启动子由于其广泛的系统发育活性而特别有前景。我们进一步表明，U6 启动子可以被大幅截短而不会影响转录水平。这些结果对于参与开发下一代基因驱动的研究人员将具有重要意义。关键词：聚合酶 III、Cas9、U6 启动子、7SK 启动子、基因驱动、蚊子