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使用 CRISPR/Cas9 和 53BP1 抑制技术通过靶向 CYBB cDNA 插入来修复 X-CGD 患者的 HSPC，从而增强同源性定向修复
蛋白质。我们在此报告了通过同源定向修复在患者造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 中进行基因校正，使用 CRISPR/Cas9 将腺相关病毒供体的 CYBB 外显子 1-13 或 2-13 cDNA 靶向插入内源性 CYBB 外显子 1 或外显子 2 位点。外显子 1-13 cDNA 的靶向插入不会恢复生理 gp91 phox 水平，这与 CYBB 表达对内含子 1 的要求一致。然而，外显子 2-13 cDNA 的插入完全恢复了吞噬细胞分化时 gp91 phox 和 ROS 的产生。添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件不会进一步增强外显子 2-13 校正细胞中的 gp91 phox 表达，表明保留内含子 1 足以实现最佳 CYBB 表达。使用 i53 mRNA 暂时抑制非同源末端连接，靶向校正增加了约 1.5 倍。在 NSG 小鼠中植入后，校正后的 HSPC 产生了吞噬细胞，并恢复了 gp91 phox 和 ROS 的产生。我们的研究结果证明了
增强同源性定向修复以实现高效……
已证明，慢病毒载体基因治疗 X 连锁慢性肉芽肿病 (X-CGD) 是一种可行的方法，但随机载体整合和转导细胞中外源启动子的蛋白质产生低于正常水平，其长期安全性和有效性仍然令人担忧。之前一种基于基因组编辑的方法使用化脓性链球菌 Cas9 mRNA 和寡脱氧核苷酸供体来修复基因突变，显示出恢复生理性蛋白质表达的能力，但在静止的 CD34 1 造血细胞中缺乏足够的效率来进行临床转化。在这里，我们报告 p53 结合蛋白 1 (53BP1) 的瞬时抑制显著增加（2.3 倍）长期同源性定向修复，从而实现高效（与健康供体对照受试者相比为 80% gp91 phox 1 细胞）的 X-CGD CD34 1 细胞的长期校正。 （《血液》2021；137(19):2598-2608）