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从 CRISPR 靶向 RNA 编辑中获得的见解......
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统，尤其是II型（Cas9）系统，在DNA打靶方面得到了广泛的发展，形成了一套成熟的精准基因编辑系统。但CRISPR-Cas系统在RNA上的基础研究和应用尚处于早期阶段。近期，CRISPR-Cas13 VI型系统的发现，为拓展RNA打靶技术提供了可能，具有广阔的应用前景。大多数VI型Cas13效应子具有双核酸酶活性，能催化前crRNA转化为成熟的crRNA，并产生较强的RNA切割活性。Cas13能特异性识别靶向RNA片段，激活Cas13/crRNA复合物进行侧切活性。 Cas13X蛋白是Cas13家族中最小的效应子，长度为775个氨基酸，由于其不受前间隔区侧翼序列（PFS）限制、易于包装、不造成永久性损伤，是一种很有前途的RNA靶向平台。本研究重点介绍了CRISPR-Cas13家族靶向RNA编辑的最新进展，并讨论了Cas13在基础研究、核酸诊断、核酸追踪和遗传病治疗中的应用。此外，我们阐明了Cas13蛋白家族的结构及其分子机制，并提出了CRISPR-Cas13家族靶向RNA编辑的未来愿景。
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
基因改造发育工程技术的历史与进展
摘要 使用改变目标基因组信息的技术进行靶向基因组修饰，已为基础生物学和应用生物学的多项研究做出了贡献。在基因打靶中，使用同源重组将打靶载体整合到靶位点。传统上，携带多个基因突变的小鼠是通过胚胎干细胞中的连续重组和耗时的单基因突变小鼠杂交产生的。然而，这种策略存在几个技术问题。第一个问题是基因打靶的频率极低，这使得获得重组克隆是一项极其耗费人力的任务。第二个问题是可以应用基因打靶的生物材料数量有限。传统的基因打靶几乎不会发生在大多数细胞系中。然而，一种使用设计核酸酶的新方法可以在基因组 DNA 中引入位点特异性双链断裂，提高了受精卵中基因打靶的效率。这种包括 CRISPR-Cas 系统的新方法也扩大了可以应用基因打靶的生物材料的数量。转基因的靶向整合可通过基于同源重组（HR）、微同源介导的末端连接（MMEJ）或非同源末端连接（NHEJ）的策略实现。本文，我们总结了靶基因修饰的各种策略，包括传统基因靶向与设计核酸酶的比较。
利用植物受精卵进行基因组编辑
: 基于构建体的 DNA 打靶。核酸研究 39 ： e82。 朱 CC，王 CC，孙 CS，许 C，尹 KC，朱 CY 和毕 FY（ 1975 ）通过氮源比较实验建立水稻花药培养的有效培养基。植物学报 15 ： 1 - 11。 Faure， J - E， Digonnet， C 和 Dumas， C（ 1994 ）玉米配子的粘附和融合的体外系统。科学 263 ： 1598 - 1600。 Holm， PB， Knudsen， S， Mouritzen， P， Negri， D， Olsen， FL 和 Roué， C（ 1994 ）从受精卵细胞机械分离的原生质体再生可育大麦植株。 Plant Cell 6 ：531 – 543。Hwang, WY, Fu, Y, Reyon, D, Maeder, ML, Tsai, SQ, Sander, JD, Peterson, RT, Yeh, JR 和 Joung, JK （2013）利用 CRISPR-Cas 系统在斑马鱼中实现高效基因组编辑。Nat Biotechnol 31 ：227 – 229。Jones, HD （2015）基因组编辑的监管不确定性。Nat Plants 1 ：14011。Koiso, N, Toda, E, Ichikawa, M, Kato, N 和 Okamoto, T （2017）从水稻和玉米中分离的卵细胞和受精卵中基因表达系统的开发。Plant Direct 1 ：e00010。 Kranz, E, Bautor, J 和 Lörz, H （ 1991 ） 单卵母细胞体外受精
在突变小鼠品系中，基因通过跳过外显子重新启动转录和翻译，从而超越基因靶向策略
小鼠胚胎干细胞或受精卵中的基因破坏是鉴定体内基因功能的传统遗传学方法。然而，由于不同的基因破坏策略使用不同的机制来破坏基因，这些策略可能导致所得小鼠模型出现不同的表型。为了确定不同的基因破坏策略是否会影响所得突变小鼠的表型，我们对通过三种常用策略（确定性敲除 (KO) 优先和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 小鼠突变株进行了表征。我们发现 Rhbdf1 对不同的 KO 策略的反应不同，例如，通过跳过外显子并重新启动翻译来潜在地产生获得功能的等位基因，而不是预期的无效或严重的次等位基因。我们的分析还显示，使用 KO 优先策略产生的小鼠中至少有 4% 表现出相互冲突的表型，这表明外显子跳过是整个基因组中普遍存在的现象。此外，我们的研究强调，至少 35% 的小鼠和 45% 的人类蛋白质编码基因可能易于发生靶向 KO 优先和 CRISPR/Cas9 介导的意外翻译。我们的研究结果对基因组编辑在基础研究和临床实践中的应用具有重要意义。简介小鼠在基因上与人类密切相关，因此选择小鼠作为模型系统来破译约 20,000 个蛋白质编码基因的功能，以深入了解人类生物学和疾病。对于大规模小鼠诱变工作，通过小鼠胚胎干 (ES) 细胞中的同源重组进行基因靶向是一种有效且通用的技术。基因靶向涉及确定性无效设计（删除目标基因的整个基因组序列）或靶向敲除 (KO) 优先设计，这提供了多种优势，包括基因破坏和报告标记突变，此外，还允许以组织特异性或时间方式分析基因功能。最近，使用 CRISPR/Cas9 直接破坏受精卵中的基因已经取代了确定性无效和 KO-first 策略。为了确定不同的基因靶向策略是否会影响纯合突变小鼠的表型，我们系统地表征了由这三种 KO 策略（确定性无效、靶向 KO-first 和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 突变小鼠。Rhbdf1 基因编码 RHBDF1，并被认为在生长发育 [1]、炎症 [2] 和癌症 [3-5] 中起关键作用。确定性无效和靶向 KO-first 策略是强大的高通量方法，可用于 ES 细胞中的大规模基因靶向，以研究数千种哺乳动物蛋白质编码基因，从而更好地了解人类生物学和疾病 [6-8]。在使用确定性无效策略时，基于细菌人工染色体 (BAC) 的打靶载体替换靶基因的整个基因组序列 (补充图 1a)，从而产生无效等位基因。相比之下，靶向 KO-first 方法 [9, 10] 是一种包括可根据所需结果选择的替代步骤的策略，具有高度的通用性，