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CRISPR/Cas 与核糖核蛋白复合物和瞬时选择端粒载体可在灰葡萄孢菌中实现高效的无标记和多重基因组编辑
CRISPR/Cas 已成为多种生物体中遗传操作的最先进的技术，能够以前所未有的效率进行有针对性的遗传改变。本文中，我们报告了在重要的坏死性植物病原体灰霉病中首次建立强大的 CRISPR/Cas 编辑，该方法基于将优化的 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物 (RNP) 引入原生质体。通过开发一种将 RNP 递送与含端粒的瞬时稳定载体共转化相结合的新策略，进一步提高了编辑产量，从而允许临时选择和方便地筛选无标记编辑事件。我们证明，与现有的基于 CRISPR/Cas 的丝状真菌方法（包括模型植物病原体稻瘟病菌）相比，这种方法提供了更高的编辑率。编辑菌株的基因组测序显示很少有额外的突变，也没有 RNP 介导的脱靶证据。端粒载体介导编辑的高性能通过随机诱变 sdhB 基因的 272 个密码子得到证实，该基因是琥珀酸脱氢酶抑制剂 (SDHI) 杀菌剂抗性的主要决定因素，方法是将 272 个密码子批量替换为编码所有 20 种氨基酸的密码子。在没有选择的情况下，所有交换的频率都相似，但 SDHI 选择允许识别新的氨基酸替换，这些替换赋予了对不同 SDHI 杀菌剂的不同抗性水平。基于 RNP 的共转化效率提高且易于操作，有望加速 B . cinerea 和其他真菌的分子研究。
使用深度神经网络对头部固定小鼠的前爪进行实时选择性无标记跟踪
这里，我们描述了一个能够以高帧率（70.17 Hz）跟踪特定小鼠爪子运动的系统，并且具有高精度（平均值 = 0.95，SD，0.01）。特定身体部位的短延迟无标记跟踪开启了操纵运动反馈的可能性。我们提出了一种基于 DeepLabCut（一种强大的运动跟踪深度神经网络框架）的软件和硬件方案，可以实时估计小鼠的爪子和手指运动。使用这种方法，当一只爪子（而不是另一只爪子）的运动有选择地超过预设阈值时，我们通过触发 USB-GPIO（通用输入/输出）控制的 LED 来演示运动生成的反馈。爪子运动开始和 LED 闪烁之间的平均时间延迟为 44.41 毫秒（SD = 36.39 毫秒），这个延迟足以应用行为触发的反馈。我们将 DeepLabCut 改编为一个开源包，用于实时跟踪，我们称之为 DeepCut2RealTime。该系统能够快速评估动物行为，其通过强化限制饮水、头部固定的小鼠的特定动作得到了证实。该系统可以为未来的研究提供参考
使用深度神经网络对头部固定小鼠的前爪进行实时选择性无标记跟踪
1) 稿件标题：使用深度神经网络对头部固定小鼠的前爪进行实时选择性无标记跟踪。 2 2) 缩写标题：使用深度神经网络实时跟踪小鼠身体部位。 3 4 3) 作者： Brandon J Forys 1,2†、Dongsheng Xiao 1†、Pankaj Gupta 1、Timothy H Murphy 1 5 1 加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华不列颠哥伦比亚大学金斯曼神经学研究实验室精神病学系 7 2 加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华不列颠哥伦比亚大学 Djavad Mowafaghian 脑健康中心心理学系 9 † 共同第一作者 10 11 4) 贡献：BF 和 DX 设计了研究、进行了研究、贡献了分析工具、分析了数据并撰写了论文。PG 贡献了分析工具。THM 设计了研究并撰写了论文。 14 15 5) 通讯地址：Timothy H Murphy 16 地址：2255 Wesbrook Mall, Detwiller Pavilion, Vancouver, BC V6T 1Z3, Canada 17 电子邮箱：thmurphy@mail.ubc.ca 18 19
使用深度神经网络对头部固定小鼠的前爪进行实时选择性无标记跟踪
1) 稿件标题：使用深度神经网络对头部固定小鼠的前爪进行实时选择性无标记跟踪。 2 2) 缩写标题：使用深度神经网络实时跟踪小鼠身体部位。 3 4 3) 作者： Brandon J Forys 1,2†、Dongsheng Xiao 1†、Pankaj Gupta 1、Timothy H Murphy 1 5 1 加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华不列颠哥伦比亚大学金斯曼神经学研究实验室精神病学系 7 2 加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华不列颠哥伦比亚大学 Djavad Mowafaghian 脑健康中心心理学系 9 † 共同第一作者 10 11 4) 贡献：BF 和 DX 设计了研究、进行了研究、贡献了分析工具、分析了数据并撰写了论文。PG 贡献了分析工具。THM 设计了研究并撰写了论文。 14 15 5) 通讯地址：Timothy H Murphy 16 地址：2255 Wesbrook Mall, Detwiller Pavilion, Vancouver, BC V6T 1Z3, Canada 17 电子邮箱：thmurphy@mail.ubc.ca 18 19
使用 CRISPR 基因编辑技术开发的第二代利什曼病疫苗，该疫苗含有无标记减毒利什曼原虫株
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是 由 此预印本的版权持有者（此版本于 2020 年 5 月 5 日发布。 ; https://doi.org/10.1101/2020.05.04.077115 doi: bioRxiv preprint
无标记深亚波长光学显微镜
图 1. 成像装置和物理训练装置。待成像的二聚体被放置在物体平面上，通过低数值孔径透镜 L1（NA=0.3）用波长为 λ = 795nm 的相干激光光源照射。在二聚体上衍射的光通过高数值孔径透镜 L2（NA=0.9）在距离二聚体 h = 2λ 处成像（a）。通过在玻璃基板上的铬膜上聚焦离子铣削制造 12 x 12 = 144 个二聚体狭缝组（b）；二聚体的狭缝具有随机宽度 A 和 C，并且以距离 B 随机间隔。在每个二聚体附近制造一个方形对准标记（c）。记录在每个二聚体上衍射的相干光的强度图案。图 (d) 显示了 50λ 宽视场中二聚体的特征衍射图案。
CTRL——一种无标记人工智能动态测量单细胞体积的方法
测量细胞的物理尺寸对于了解细胞生长控制很有价值。目前用于哺乳动物细胞的单细胞体积测量方法劳动密集、不灵活且可能导致细胞损伤。我们引入了 CTRL：细胞拓扑重建学习器，这是一种无标记技术，结合了深度学习算法和荧光排除方法，仅从微分干涉对比 (DIC) 显微镜图像中重建细胞拓扑并估计哺乳动物细胞体积。该方法实现了定量准确性，需要的样品制备最少，并且适用于广泛的生物和实验条件。该方法可用于跟踪任意长时间段内的单细胞体积动态。对于 HT1080 纤维肉瘤细胞，我们观察到分裂时的细胞大小与出生时的细胞大小 (sizer) 呈正相关，并且在 HT1080 纤维肉瘤细胞中，在细胞周期完成 25% 时，细胞大小波动明显减少。
CRISPR/Cas 与核糖核蛋白复合物和瞬时选择端粒载体可在灰葡萄孢菌中实现高效的无标记和多重基因组编辑
。CC-BY 4.0 国际许可永久有效。它是在预印本下提供的（未经同行评审认证），作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在