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World File Search System杂交种
12 种桉树的再生和农杆菌介导的遗传转化
摘要 桉树属有 900 多个品种和杂交种，其中许多是珍贵的速生硬木。由于其经济重要性，桉树是较早被破译基因组的树种之一。然而，缺乏有效的遗传转化系统严重制约了该植物的功能基因组学研究。桉树再生和转化的成功在很大程度上取决于基因型和外植体。在本研究中，我们系统地筛选了 12 个桉树品种的 26 个基因型，试图获得具有高再生潜力的桉树基因型。我们开发了两种常见的再生培养基，可用于大多数受试桉树基因型的播种下胚轴和克隆的节间作为外植体。然后，我们使用 DsRed2 作为遗传转化效率测试的视觉标记。我们的结果表明，E. camaldulen 和 E. robusta 适合进行遗传转化。最后，我们分别使用播种下胚轴和克隆节间成功地建立了稳定的农杆菌介导的桉树和桉树的遗传转化程序。总之，我们的研究为桉树的无性繁殖、基因转化、基于 CRISPR 的基因诱变、激活和抑制以及基因的功能表征提供了有价值的手段。
附录 36——填海计划
必须谨慎和规划，选择适合特定场地条件的混合物和数量。还必须规划和考虑选择成功的种植和场地准备技术。所有场地必须种植多种草、草本植物和灌木的混合物，才算成功。项目发起人最终负责成功恢复受干扰的场地。项目发起人可以在使用前向 BLM 提交替代种子混合物以供审查和批准。最终目标是恢复受干扰的场地，使其与受干扰前的本地植物群落非常相似。罗林斯实地办公室提供一些标准种子混合物，仅包含本地物种。如果需要使用非本地物种，BLM 政策要求提供需求证明。可以考虑使用非本地物种来防止侵蚀和控制杂草。可以使用由无菌一年生覆盖作物（如三叶草杂交种）组成的种子混合物。不建议使用小麦等非无菌植物作为覆盖作物，因为它具有自我再播种的能力。对于在合理时间内未能达到复垦成功标准的表面扰动区域，需要采取后续播种或纠正侵蚀控制措施。
凯蒂·马丁·雷尼博士的证词
培育和分发最好的种子和其他库存对于美国农业生产力和粮食安全至关重要，需要在研发方面进行大量投资。通过公私合作开展的农业研究，包括种子公司、大学和联邦研究机构，是作物改良和美国农民获得最佳品种和杂交种的基础。ASTA 的许多成员公司与像我这样的公共部门研究项目密切合作，以造福公众。感谢你们今天举行这次听证会，强调农业研究作为农业法案基础的重要性，并最终确保农业生产和粮食系统的安全可靠。由于长期以来公共和私人对研究的大力投资，今天的美国农民在同样的土地上用更少的资源生产出越来越多的产品，美国农民在全球粮食安全中发挥着巨大作用。现在，农民和其他从事农业的人都在努力提高美国农业实践的可持续性。但是，现在美国农业生产比以往任何时候都面临着一系列复杂的新兴威胁，如极端天气和新害虫，同时还需要提供增强的生态系统服务，如改善水质。人们对农作物本身的期望越来越高，它们不仅越来越多地提供食物，还提供可再生燃料和肉类替代品，同时还能固碳并减少化肥使用。
二合一育种策略促进野生种和优良品种的快速利用
全球气候变化对现代农业和粮食安全构成挑战。作物育种中的密集选择大大缩小了适应气候的遗传多样性（Atherton and Rudich，1986；Lin 等人，2014）。例如，现代栽培品种仅占番茄资源总遗传变异的约 5%（Atherton and Rudich，1986）。这些挑战迫切需要开发新策略来利用野生物种，野生物种是尚未开发的理想抗逆性状的来源，以加速气候智能型作物的育种。基因组编辑已显示出其作为一种快速而精确的育种技术的威力，但创造由多个定量基因座支撑的复杂多基因性状（例如抗逆性状）仍然具有挑战性（Gao，2021）。特别是，由于基因编辑在植物中敲入和敲出效率低下，许多理想性状很难通过基因编辑创造。通过遗传杂交将野生亲属的抗逆性状引入优良品种可取得这样的成功。然而，由于遗传障碍、野生物种生长习性差异大以及优良品种人工去雄的劳动力成本等多重障碍，基因导入进程往往缓慢且耗费人力。例如，虽然目前番茄种子目录以 F 1 杂交种为主，但番茄种子生产成本高昂且费力，因为它需要对种子亲本逐一进行人工去雄，并进行授粉（Atherton 和 Rudich，1986 年）。
隐性种间杂交 Lemna×... 的表征
这些微小的自由漂浮被子植物的特殊形态对浮萍科的分类学提出了挑战。尽管分子分类学有助于阐明该科的系统发育历史，但形态学数据的一些不一致导致浮萍属经常被错误分类。最近，Lemna japonica 是 Lemna minor 和 Lemna turionifera 的种间杂交种，这一发现为此类分类学问题提供了一个清晰的解释。在这里，我们证明了 L. minor 也能够与 Lemna gibba 杂交，从而在地中海地区产生一个隐秘但广泛分布的分类单元。描述了非分类单元 Lemna × mediterranea，并将其与假定的亲本种 L. minor 和 L. gibba 的克隆进行了比较。通过核和质体标记的遗传分析以及基因组大小测量表明，两种不同的细胞型（二倍体和三倍体）起源于至少两个独立的杂交事件。尽管总体相似性很高，但形态测量、生理和生化分析表明，L. × mediterranea 在大多数定性和定量特征上处于其亲本物种的中间位置，并且两种杂交细胞型也根据某些标准分开。这些数据证明，杂交和多倍化（陆生植物进化的驱动力）有助于浮萍的遗传多样性，并可能塑造了这些主要无性水生植物的系统发育历史。
C. richardii 的生物学作为了解植物的工具......
引言 水蕨属 (Ceratopteris) 的分类历史悠久而复杂。它最早由林奈 (Linnaeus) 描述为 Acrostichum 属 (Linnaeus, 1764)，后来布隆尼亚 (Brongniart) (Brongniart, 1821) 将水蕨命名为水蕨 (Ceratopteris)。从那时起，水蕨被归入许多不同的科，属内物种数在 1 到 12 种之间 (Lloyd, 1974)。如今，它被归入蕨科，这是最大的和最具多样性的蕨类植物科之一 (PPG, 2016；图 1)。水蕨属大约有 10 个物种，遍布整个热带地区 (图 2；Masuyama 和 Watano, 2010；Zhang 等, 2020；Yu 等, 2021)。由于形态不一致，这些物种的分类变得困难，需要采用分子方法来重建该属的主干系统发育 ( Adjie 等人，2007 年；Kinosian 等人，2020 年 a)。最近的研究表明，隐蔽种和杂交种在水蕨属中可能相当常见，需要更严格地评估该属物种之间的关系 (例如，Kinosian 等人，2020 年 b)。水蕨属植物最初在 20 世纪 60 年代和 70 年代被开发为蕨类植物的模型系统，主要是因为它易于在实验室中生长并且生命周期短 (图 2 ；Pal 和 Pal，1962 年；Pal 和 Pal，1963 年；Klekowski，
蓝莓育种的经验教训
蓝莓（Vaccinium corymbosum 和杂交种）是一种特种作物，其产量和消费量在世界范围内不断扩大。佛罗里达大学 (UF) 的蓝莓育种计划通过开发更适合全球亚热带和地中海气候的耐寒品种，极大地促进了蓝莓产区的扩大。该育种计划历来侧重于表型轮回选择。作为一种同源多倍体、异交、多年生、幼年期较长的作物，蓝莓的育种周期成本高且耗时长，导致单位时间内的遗传增益低。受分子标记在育种早期阶段进行更准确选择的启发，我们进行了开创性的基因组预测研究和优化，以实施蓝莓育种计划。我们还解决了同源多倍体作物基于序列的基因分型和模型参数化的一些复杂性，提供了可以扩展到其他多倍体物种的经验贡献。我们在此回顾了我们之前的一些基因组预测研究，并描述了目前在作物方面取得的成就。在本文中，我们对同源四倍体作物基因组预测的贡献有三方面：i) 总结了模型参数化（例如二倍体或多倍体方法）的相关性以及显性效应的纳入的先前结果；ii) 评估序列覆盖深度和基因型剂量调用步骤的重要性；iii) 通过使用独立验证集展示基因组选择对利用育种决策的真正影响。总之，我们提出了一种在蓝莓中使用基因组选择的策略，并有可能应用于具有类似背景的其他多倍体物种。
实现 CRISPR/Cas 介导的基因组编辑的策略，无需转基因整合即可直接获得编辑植物
在过去的一个世纪里，随着植物遗传学理解的加深以及强大且易于使用的基因编辑工具的开发，人类传递精确作物基因型的能力发生了革命性的变化。植物转化技术已经很发达，可用于在某些作物和模式生物中制造转基因品种，但试剂输送和植物再生仍然是将基因编辑技术应用于大多数作物的关键瓶颈。生产转基因、基因改造 (GM) 品种的典型植物转化方案依赖于转基因、化学选择和组织培养。制造基因编辑 (GE) 品种的典型方案也使用转基因，即使这些转基因可能对最终的作物产品不利。在某些作物中，转基因通常在减数分裂期间通过杂交分离出来，因此这只是一个次要的问题。在其他作物中，特别是那些无性繁殖的作物、复杂的杂交种或世代时间长的作物，这种杂交是不切实际的或不可能的。本综述重点介绍了将 CRISPR/Cas 基因编辑试剂递送至可再生植物细胞并恢复已编辑植物而不产生不必要的转基因整合的各种策略。一些示例包括递送无 DNA 的基因编辑试剂（如核糖核蛋白或 mRNA）、依赖非整合 DNA 的试剂表达、使用病毒或纳米颗粒等新型递送机制、使用非常规选择方法避免转基因整合和/或完全避免组织培养。这些方法正在迅速发展，并已使作物科学家能够利用 CRISPR 基因编辑工具的精确性。
全寄生植物向日葵列当（Orobanche cumana Wallr）首次进化出抗除草剂的现象。
大约 20 年前，对乙酰乳酸合酶 (ALS) 抑制除草剂具有耐受性的向日葵品种的开发和商业化为农民提供了一种经济有效的控制 Orobanche cumana 的替代方法。然而，在 2020 年，据报道，在施用 ALS 抑制除草剂甲氧咪草烟后，来自希腊德拉马 (GR-DRA) 和奥雷斯蒂亚达 (GR-ORE) 的两个独立的向日葵列当种群被 O. cumana 严重侵染。在这里，我们研究了 GR-DRA 和 GR-ORE 的种群，并确定了两个希腊 O. cumana 样本对甲氧咪草烟的抗性基础。使用一组五种具有不同抗 O. cumana 侵染基因的诊断性向日葵品种，我们已清楚地确定 GR-ORE 和 GR-DRA 种群分别属于入侵列当菜品系 G 和 G+。在使用两种不同的耐除草剂向日葵杂交种作为宿主的全植物剂量反应测试中，在推荐的田间伊马草烟用量下，对 GR-DRA 和 GR-ORE 发现了活的地下结节和出苗，但对另外两个标准敏感种群则未发现。ALS 基因测序发现所有 GR-ORE 样本中都存在丙氨酸 205 到天冬氨酸的突变。大多数 GR-DRA 结节具有第二个丝氨酸 653 到天冬酰胺的 ALS 突变特征，而少数 GR-DRA 个体含有 A205D 突变。已知 ALS 密码子 205 和 653 的突变会影响甲氧咪草烟和其他咪唑啉酮除草剂的结合力和功效。此处产生的知识对于追踪和管理向日葵种植区列当对 ALS 抑制除草剂的抗性非常重要。
通过 Cas12a/CBE 共编辑在 T0 代中产生无转基因抗溃疡病 Citrus sinensis cv. Hamlin
柑橘溃疡病影响柑橘生产。该病由柑橘黄单胞菌（Xcc）引起。先前的研究证实，在 Xcc 感染期间，转录激活因子样效应物 (TALE) PthA4 会从病原体转移到宿主植物细胞中。PthA4 与溃疡病易感基因 LOB1（EBE PthA4 -LOBP）启动子区中的效应物结合元件 (EBE) 结合，激活其表达，随后引起溃疡症状。之前，采用 Cas12a/CBE 共编辑方法破坏高度纯合的柚子的 EBE PthA4 -LOBP。然而，大多数商业柑橘品种都是杂合杂交种，更难产生纯合/双等位基因突变体。在这里，我们采用 Cas12a/CBE 共编辑方法来编辑 Hamlin（Citrus sinensis）的 EBE PthA4 -LOBP，这是一种在世界范围内种植的商业杂合柑橘品种。构建了二元载体 GFP- p1380N-ttLbCas12a:LOBP1-mPBE:ALS2:ALS1，并证明其可通过 Xcc 促进的农杆菌素过滤在 Hamlin 叶片中发挥作用。该构建体允许通过 GFP 选择无转基因再生体，编辑 ALS 以生成抗氯磺隆再生体作为基因组编辑的选择标记，这是通过 nCas9-mPBE:ALS2:ALS1 瞬时表达 T-DNA 的结果，并通过 ttLbCas12a 编辑感兴趣的基因（即本研究中的 EBE PthA4 -LOBP），从而产生无转基因柑橘。共产生了 77 株幼苗。其中 8 株幼苗为转基因植株（#Ham GFP 1 - #Ham GFP 8），4 株幼苗为非转基因植株（#Ham NoGFP 1 - #Ham NoGFP 4），其余为野生型。在 4 株非转基因幼苗中，三个品系（#Ham NoGFP 1、#Ham NoGFP 2 和 #Ham NoGFP 3）含有 EBE pthA4 的双等位基因突变，一个品系（#Ham NoGFP 4）含有 EBE pthA4 的纯合突变。我们在 C. sinensis cv. Hamlin 中实现了 EBE PthA4 – LOBP 的 5.2% 非转基因纯合/双等位基因突变效率，而之前研究中柚子的突变效率为 1.9%。重要的是，存活下来的 4 株无转基因植株和 3 株转基因植株均能抵抗柑橘