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已测试至少20 nt。探针可以用3´或5´生物素/Desthiobiotin亲和力组设计，用于链霉亲和素富集（NEB＃S1421）。为了获得最佳结果，受保护的DNA：RNA杂交区应为4或5个核苷酸
胜任的细胞
比较Engen间谍Cas9 NLS，Engen Spy Cas9 HF1的指南RNA序列和目标DNA序列之间的不匹配的耐受性，以及其他商业可用的高保真cas9变体。与荧光标记的DsDNA底物编码单个，双或三倍不匹配的几个指南RNA之一，可以与五个Cas9变体中的每一个形成核糖核蛋白（RNP）复合物。将完全匹配的导向RNA作为对照包括。将RNP与底物在37°C下以2：1的比率孵育5分钟。通过毛细管电泳测量每个RNP复合物的底物裂解百分比。的结果是作为热图的图形图形，白色代表没有裂解和蓝色强度的增加，表明裂解百分比增加。指南RNA序列在每一行中指示，并以绿色表示不匹配。DNA原始序列序列为5´ - agaactggcagagaggagggtag - 3´，而原始的邻接基序（PAM）为5´– TGG - 3´。Engen间谍Cas9 HF1通过显示出靶向裂解与平均脱靶裂解的最大比例，表现出对不匹配的敏感性提高。
