细胞和基因治疗:在这种治疗中,使用病毒或基因组编辑来编辑基因组。由此产生的遗传异质性可能会影响这种治疗的安全性和有效性,但传统方法,例如扩增转基因细胞、分离克隆、通过测序或qPCR分析编辑效率,非常耗时费力。由于对细胞进行单独分析,单细胞分析可以跳过克隆扩增步骤,从而节省时间。此外,基因转移/基因组编辑的效率和意外易位的检测可以在单次检测中进行(图3)。
国枝武一 副教授 近藤小之(研究时):特任研究员 现:千叶工业大学先进工程学院生命科学系助理教授 田中章宏(研究时):博士生 现:日本学术振兴会遗传学研究所研究员 论文信息 期刊名称:PLOS Genetics 标题:使用 DIPA-CRISPR 在极端耐受性孤雌生殖缓步动物中单步生成纯合敲除/敲入个体 作者:近藤小之、田中章宏、国枝武一*(*:通讯作者) DOI:10.1371/journal.pgen.1011298 URL:https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1011298 研究资助本研究获得以下项目的资助:“缓步动物特异非结构域蛋白的发现与功能分析(项目编号:21H05279)”、“耐受极端环境的缓步动物抗性机制的动力学与新分子原理阐明(项目编号:20K20580)”、“高抗辐射缓步动物保护与修复新机制阐明(项目编号:20H04332)”。 名词解释(注1) 缓步动物 一种缓步动物,学名是 Ramazzottius varieornatus。从北海道札幌市的一座桥上分离出的单个个体衍生的遗传同质种群(YOKOZUNA-1谱系)已在实验室中进行了连续繁殖,并且由于其基因组已被破译,它被用于缓步动物的分子生物学研究。它们通过孤雌生殖进行繁殖,雌性单独产卵而不交配。它们具有一种特殊的耐干燥性,称为“干燥切开术”,这使它们能够承受几乎完全脱水,并且在这种状态下,它们能够抵抗各种极端压力。 (注2)目标基因:该技术允许研究人员只修改他们想要研究的特定基因。本研究以参与细胞内物质运输的蛋白质(转运蛋白)和海藻糖合成酶基因为靶基因,进行基因组改造。 (注3)敲除个体、敲入个体 通过人为地向目标基因中引入突变来破坏该基因功能的个体称为敲除个体。另一方面,研究人员设计的 DNA 序列被整合到基因组的目标位置的个体被称为敲入个体。
我们的结果表明,NEIL1 作用于 8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-羟基鸟嘌呤),导致多个尿嘧啶损伤,从而诱导远处位点的突变。这意味着 NEIL1 具有双重作用,既可以防止氧化鸟嘌呤形成位点发生突变,同时又可以通过诱导远处位点损伤的产生来促进突变。 OGG1 具有类似的功能,表明它并不是一个例外的实体。 [未来发展] 未来我们将阐明 NEIL1 和 OGG1 之间的关系以及远距离位点发生突变的机制。预计该研究结果将有助于更好地了解致癌机制并开发抑制致癌的方法。 [参考资料] 论文标题:NEIL1:参与 8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤诱导的远距离作用突变的第二个 DNA 糖基化酶 作者:Yoshihiro Fujikawa、Tetsuya Suzuki、Hidehiko Kawai、Hiroyuki Kamiya* (*通讯作者) 期刊:Free Radical Biology and Medicine 于 1 月 21 日在线发表。以下是该论文的链接。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584925000516
基因分析的应用范围十分广泛,包括医学、法医学和农业。在传染病领域,可以通过特异性检测病原体的DNA或RNA来识别病原体。在法医学领域,从生物样本(血液、头发等)中提取的DNA信息被用作识别罪犯的证据。此外,在农业领域,人们进行基因分析是为了从农作物和牲畜中选出有用的个体。在进行此类基因分析时,通常需要从生物组织等样本中提取核酸(DNA和RNA)作为预处理步骤。
(说明)[背景]试图研究基因的作用时,一种方法是防止基因工作并分析其结果。 CRISPR-CAS9是一种基因组编辑方法之一,被广泛用于停止此类基因的功能。但是,许多生存必不可少的基因很难研究,因为功能障碍可能会产生致命作用。在此类问题的情况下,研究是通过部分抑制基因功能而不是完全停止基因功能来完成的。但是,许多用于此目的的实验方法都是困难且不稳定的,并且希望开发一种简单稳定的方法来抑制基因功能。因此,在这项研究中,我们通过设计CRISPR-CAS9的使用来开发一种简单而稳定的方法,用于产生部分抑制突变体。 [研究含量]基因组DNA是生物生物的蓝图,遵循称为中心教条 *2的基本原理,并产生mRNA和蛋白质以调节细胞的功能。在“真核生物”中,是含有拟南芥 *3的植物,包括人类在当前研究中使用的动物,在从DNA产生mRNA之后,将部分mRNA切除(拼接 *4)形成成熟的mRNA。 DNA包含控制剪接的序列,但是如果在此部分发生异常,则剪接后的mRNA和蛋白质序列将变得异常。 在这项研究中,使用CRISPR-CAS9进行了基因组编辑,以创建这种异常。 CRISPR-CAS9系统旨在针对使用Gene HPY2控制剪接的序列,据报道,该基因在拟南芥中的功能显着降低,据报道,该拟南芥在模型植物的拟南芥中发芽的几天内致死。结果,我们成功地创建了拟南芥,该拟南芥具有一个序列,其中剪接控制顺序按预期去除。此外,我们证实了拟南芥中从HPY2基因产生的成熟mRNA序列比正常生成的成熟mRNA序列略短。与正常的蛋白质相比,由该mRNA产生的蛋白质可能缺乏一些序列。但是,保留了粗糙的结构,表明某些蛋白质的功能可能仍然存在。实际上,本研究中产生的突变体HPY2-CR3能够比完全失去已知HPY2基因的功能并受到致命影响的功能的寿命更长,并且有些人能够成长为可以开花的阶段。
细菌免疫。Science。337 : 816-821, 2012。6)Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF.: 基于ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas 的基因组工程方法。Trends. Biotechnol. 31 : 397-405, 2013。7)Doudna JA, Charpentier E.: 基因组编辑。利用CRISPR-Cas9 进行基因组工程的新前沿。Science。346 : 1258096, 2014。8)Strecker J, Ladha A, Gardner Z 等:利用CRISPR 相关转座酶进行RNA 引导的DNA 插入。Science。 365 :48-53,2019。9)Klompe SE,Vo PLH,Halpin-Healy TS 等:转座子编码的 CRISPR-Cas 系统直接介导 RNA 引导的 DNA 整合。Nature。571 :219-225,2019。10)Jacobi AM,Rettig GR,Turk R 等:用于高效基因组编辑的简化 CRISPR 工具及其向哺乳动物细胞和小鼠受精卵中的精简协议。方法。121-122 :16-28,2017。11)Lino CA,Harper JC,Carney JP 等:CRISPR 的递送:挑战和方法综述。药物递送。 12)Kaneko T.:用于产生和维持有价值动物品系的生殖技术。J. Reprod. Dev. 64:209-215,2018。 13)Mizuno N,Mizutani E,Sato H等:通过腺相关病毒载体通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑实现胚胎内基因盒敲入。iScience。9:286-297,2018。 14)Yoon Y,Wang D,Tai PWL等:利用重组腺相关病毒在小鼠胚胎中精简体外和体内基因组编辑。Nat. Commun. 9 : 412, 2018。15)Takahashi G, Gurumurthy CB, Wada K, 等:GONAD:通过输卵管核酸递送系统进行基因组编辑:一种新型的小鼠微注射独立基因组工程方法。Sci. Rep. 5 : 11406, 2015。16)Sato M, Ohtsuka M, Nakamura S.:输卵管内滴注溶液作为在体内操纵植入前哺乳动物胚胎的有效途径。New Insights into Theriogenology, InTechOpen, London, 2018, pp 135-150。 17)Sato M,Takabayashi S,Akasaka E 等:基因组编辑试剂在小鼠生殖细胞、胚胎和胎儿体内靶向递送的最新进展和未来展望。Cells。9:799,2020。18)Alapati D,Zacharias WJ,Hartman HA 等:宫内基因编辑治疗单基因肺疾病。Sci. Transl. Med。11:eaav8375,2019。19)Nakamura S,Ishihara M,Ando N 等:基因组编辑成分经胎盘递送导致中期妊娠小鼠胎儿胚胎心肌细胞突变。IUBMB life。 20)Sato T, Sakuma T, Yokonishi T 等:利用 TALEN 和双切口 CRISPR/Cas9 在小鼠精原干细胞系中进行基因组编辑。Stem Cell Reports。5:75-82,2015。21)Wu Y, Zhou H, Fan X 等:通过 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑纠正小鼠精原干细胞中的一种遗传疾病
本次研究分析的最古老的样本是从东京湾野岛贝冢(横滨市金泽区)出土的一只太平洋斑纹海豚,可追溯到大约 8,000 年前。研究发现,如果保存得当,即使在横滨这样炎热潮湿的环境中,DNA分子仍可以保留在这些古老的样本中。 在北海道东部的钏路地区,我们调查了两处遗址:东钏路贝冢(钏路市贝冢),其年代为绳文时代早期至中期;以及币舞遗址(钏路市币舞町),其年代为绳文时代晚期至后绳文时代。样本的年龄表明,东钏路贝丘的海豚捕鱼活动大约在 4,200 年前结束,之后经过 1,000 多年的间隔,直到大约 3,000 年前币舞遗址的海豚捕鱼活动才恢复(图 3)。此外,特别是在太平洋斑纹海豚中,东钏路贝冢和币舞遗址出土的个体之间几乎没有共同的线粒体单倍型,这表明从这两个遗址出土的太平洋斑纹海豚属于遗传上不同的群体。已知距今4200年前,全球范围内发生过一次突然变冷干燥事件(4200年前事件)。例如,气候变化被认为是古埃及王国灭亡和美索不达米亚阿卡德帝国覆灭的原因之一。据报道,在日本列岛,这种突然的降温导致了当时最大的定居点之一的三内丸山遗址(青森市)的废弃,并导致了礼文岛的植被大规模变化。本研究提出的海豚种群更替和钏路地区海豚捕捞的暂停也可能与此有关
【案例一:人类基因组计划】1990年前后,美国 破译人类基因组不仅会对研究人员和医疗实践产生影响,而且会对每个人和整个社会产生影响。 (保护遗传信息=个人信息、防止基于遗传信息的歧视等)因此,不仅研究人员、医生、患者,而且更广泛意义上的社会也有必要讨论在何种程度上才是“可以接受的”。
图 1. 突变线粒体 DNA (mtDNA) 的遗传特征和致病表达模型。人们认为,mtDNA 中的突变会随着衰老而积累。仍有许多未解之谜,比如这些突变是如何遗传和增加的,从而导致线粒体功能下降,甚至随着时间的推移导致细胞和个体功能下降(详情见正文)。