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CRISPR-Cas9 在体内诱导靶位点和非靶位点的大结构变异，这些变异会在几代之间分离
。CC-BY-NC 4.0 国际许可，根据 （未经同行评审认证）提供，是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2021 年 10 月 5 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.10.05.463186 doi：bioRxiv 预印本
一种通用且快速的 CRISPR 脱靶位点检测工具
背景：II 型成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 是一种强大的基因组编辑技术，在基因功能分析中越来越受欢迎。在 CRISPR/Cas 中，RNA 引导 Cas 核酸酶到靶位点进行 DNA 修饰。结果：CRISPR/Cas 的性能取决于精心设计的单向导 RNA (sgRNA)。然而，sgRNA 的脱靶效应会导致基因组中出现不良突变，从而限制了 CRISPR/Cas 的使用。在此，我们介绍了一种通用且快速的 CRISPR 脱靶检测工具 OffScan。结论：OffScan 不受错配数量的限制，并允许自定义原型间隔区相邻基序 (PAM)，这是 Cas 蛋白的靶位点。此外，OffScan 采用 FM 索引，可有效提高查询速度并减少内存消耗。
解码靶向整合的复杂性：使用纳米孔测序表征 CRISPR-Cas9 靶位点的 DNA 插入
考虑到纳米孔测序的~5%测序错误（主要是插入和缺失）和供体片段的部分截断整合，我们在分配数据时基于预期的完美插入大小将间隔扩大±20%。然后，我们用正向骨架插入（Bf）、反向骨架插入（Br）、正向F8盒式插入（F8f）和反向F8盒式插入（F8r）的grepseqs分析了9个数据集特定长度范围内的数据。最后，我们计算出F8盒式插入和骨架整合的比例，分别为40.24%和44.47%。有趣的是，完全供体整合占总插入事件的14.16%，而其余的插入涉及两个相同的片段和三个片段的整合（图5B）。
IDT Alt-R Sp HiFi Cas9 核酸酶 V3 (CRS-10083-FL 03/19)
图 1. Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 促进近野生型靶向编辑效力并显著减少脱靶位点编辑。RNP 复合物由 Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3 或 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 与靶向 EMX1 基因的 Alt-R crRNA:tracrRNA 复合物结合形成。RNP 复合物 (4 µM) 通过 Nucleofection™ 方法 (Lonza) 递送到 HEK-293 细胞中。通过下一代测序 (rhAmpSeq 扩增子测序，IDT) 测量了靶位点和 9 个已知脱靶位点处的插入/缺失形成 (在 y 轴上以对数标度表示)。
ONE-seq 用于变异感知治疗指南选择
ONE-seq 利用计算工具和生化分析，以高灵敏度在数千个基因组中提名候选脱靶位点。在这里，我们介绍了 ONE-seq 的一种应用，用于识别具有最低潜在脱靶编辑风险的指南。生化体外裂解数据通过生物学注释得到增强，以便根据其潜在影响对高分位点进行优先排序。我们以变异感知的方式应用 ONE-seq，在全球人类群体中提名三种针对 PCSK9 基因的治疗相关向导 RNA 的脱靶位点。通过筛选 HG38 参考序列和来自 1000 基因组和人类基因组多样性项目数据集的 4000 多个基因组，生成了全面的 ONE-seq 文库，其中包括与靶位点相比最多有 6 个差异的位点。通过 ONE-seq 分析确定候选脱靶位点，并根据其 ONE-seq 编辑分数和组合注释关注分数将其分为多个层级。使用 ONE-seq Screen 在一次运行中筛选多个指南的方法简化了指南选择过程并降低了分析大量候选指南的成本。
利用泛素化对 CRISPR-Cas9 系统进行改进......
以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术已广泛应用于基因功能分析、基因治疗、作物改良等多个生物领域。然而面对真核生物基因组的复杂性，CRISPR-Cas9基因组编辑工具表现出编辑效率不稳定、在不同靶位点差异性大等问题，进一步提高CRISPR-Cas9系统在全基因组范围内的编辑效率具有重要意义。本研究在前期单转录单元基因组编辑系统（STU-SpCas9）的基础上，利用泛素相关结构域（UBA）增强Cas9蛋白的稳定性，构建了三种Cas9-UBA融合系统（SpCas9-SD01、SpCas9-SD02、SpCas9-SD03）。选取水稻OsPDS、OsDEP1和OsROC5基因的4个不同靶位点，对水稻原生质体和稳定转化水稻植株的基因组编辑效率进行评价，结果表明UBA结构域的融合不影响Cas9蛋白的切割方式，且能有效提高STU-SpCas9在靶位点的编辑效率。该新型CRISPR-Cas9-UBA系统为提高CRISPR-Cas9在植物中的基因组编辑效率提供了新的策略和工具。
CRISPR/Cas9 gRNA 载体
• 并行使用至少两个独立的 gRNA 序列来获得不同的克隆。通过基因组编辑创建的模型使用不同的 gRNA，这些 gRNA 共享靶位点，但不共享脱靶位点，是创建独立重复的绝佳方法。 • 为每个使用的 gRNA 分离多个独立的克隆细胞群。在独立克隆中，脱靶 DSB 发生在相同位点的可能性非常低。 • 虽然很少有实验室有资源进行统计上强大的全基因组测序验证协议（例如 gUIDEseq），但相对容易地为每个您使用的 gRNA 选择几个预测的脱靶序列，然后围绕这些位点进行测序，以确保没有引入脱靶插入/缺失。
一个基因组还是数千个基因组？群体基因组学和脱靶风险
使用 SpCas9 核酸酶进行 ONE-seq 脱靶分析的结果 a，群图显示五个先前分析的 SpCas9 gRNA 的 ONE-seq 核酸酶分数。每个圆圈代表一个单独的 ONE-seq 文库成员。彩色圆圈代表先前确认的真正脱靶位点。未显示 ONE-seq 核酸酶分数低于 0.001 的位点。n/a，未在先前发表的 CIRCLE-seq 研究中进行验证。b，维恩图比较了 ONE-seq、CIRCLE-seq 和 Digenome-seq（空心彩色圆圈）提名先前由 GUIDE-seq（实心紫色圆圈）验证的真正脱靶位点的能力。所有被视为由 ONE-seq 验证的位点的 ONE-seq 核酸酶分数均 >0.01。
使用CRISPR/CAS9系统对I型粘多糖含量的潜在脱靶位点的硅胶分析：对人群特异性治疗的影响
粘多糖含量I型（MPS I）是由IDUA基因编码的α-l-二维罗苷酶缺乏引起的。用CRISPR/CAS9的治疗正在开发用于治疗，但是必须对脱靶效应进行详细研究。本研究旨在评估旨在纠正MPS I患者最常见变体的SGRNA的可能脱离目标（P.TRP402 *）。在至少一个人群中，在这些序列中鉴定了共272个势靶序列，并在这些序列中鉴定出84个聚形态位点，其频率等于或大于1％。在大多数情况下，多态性位点减少了脱靶裂解的机会，并创建了新的PAM，这表明了这种分析的重要性。这项研究强调了使用I型粘二糖化病在人群特定环境中筛选靶点的重要性，作为与所有治疗治疗有关的问题的一个例子。我们的结果可以为已经在临床上使用的其他目标提供更广泛的应用，因为它们可能会影响CRISPR/CAS9的安全性和效率。