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针对 SARS-CoV-2 主蛋白酶的药物耐药潜力的系统分析
针对 SARS-CoV-2 主要蛋白酶 (M pro ) 的药物是已进入临床使用的有效治疗方法。这些药物的大规模使用将对耐药突变的进化施加选择压力。为了了解 M pro 的耐药潜力，我们对可能导致酵母筛选对尼玛瑞韦 (包含在药物 Paxlovid 中) 和目前处于 III 期试验的恩西瑞韦 (Xocova) 产生耐药性的氨基酸变化进行了全面调查。最近在尼玛瑞韦的多项病毒传代研究中报告的最具影响力的耐药突变 (E166V) 对尼玛瑞韦显示出最高的耐药性评分，而 P168R 对恩西瑞韦显示出最高的耐药性评分。使用系统方法评估潜在的耐药性，我们发现了 142 种尼玛瑞韦耐药突变和 177 种恩西瑞韦耐药突变。在这些突变中，有 99 种对两种抑制剂都产生了明显的耐药性，这表明很有可能出现交叉耐药性。许多表现出抑制剂特异性耐药性的突变与每种抑制剂突出底物包膜的不同方式一致。此外，具有强耐药性评分的突变往往功能减弱。我们的结果表明，尼玛瑞韦或恩西特瑞韦的强大压力将选择多种不同的耐药谱系，这些谱系将包括削弱与药物相互作用同时降低酶功能的原发性耐药突变和增加酶活性的继发性突变。全面识别耐药突变使得能够设计出具有降低耐药性潜力的抑制剂，并有助于监测循环病毒群中的耐药性。
VARIVAX ® 冷藏水痘病毒活疫苗（...
澳大利亚产品信息 – VARIVAX ® 冷藏水痘病毒活疫苗（活水痘疫苗） 1 药品名称 活水痘疫苗 2 定性和定量成分 3 剂型 VARIVAX 冷藏 [水痘病毒活疫苗（Oka/Merck）] 是 Oka/Merck 减毒活水痘病毒株的冻干制剂。该病毒最初从患有野生型水痘的儿童身上获得，然后引入人类胚胎肺细胞培养物中，适应并在胚胎豚鼠细胞培养物中繁殖，最后在人类二倍体细胞培养物中繁殖（WI-38）。美国新泽西州拉威市 Merck Sharp & Dohme, LLC 研究实验室在不含外来因子的人类二倍体细胞培养物 (MRC-5) 中对水痘疫苗病毒进行了进一步的传代。按说明配制后，VARIVAX Refrigerated 是用于肌肉注射 (IM) 或皮下注射 (SC) 的无菌制剂。每 0.5 mL 剂量含：配制并在室温下储存 150 分钟（2 个半小时）时至少含 1350 PFU（空斑形成单位）的 Oka/Merck 水痘病毒。注射用粉针 VARIVAX Refrigerated 配制后为无色至淡黄色澄清液体。已知作用的辅料列表：这种疫苗可能含有微量的新霉素。有关辅料的完整列表，请参见第 6.1 节辅料列表。该产品还含有 MRC-5 细胞的残留成分和微量新霉素，以及来自 MRC-5 培养基的牛血清。该产品不含防腐剂。该产品的制造包括接触牛源材料。没有证据表明任何 vCJD（被认为是人类形式的牛海绵状脑病）病例是由任何疫苗产品的给药引起的。
2017-18 年流感季节期间细胞培养疫苗相对于鸡蛋灭活流感疫苗的疫苗有效性
人们担心流感疫苗的有效性 (VE) 可能会因在生产过程中在鸡蛋中传代而减弱。我们比较了四价细胞培养疫苗与鸡蛋疫苗（其中大多数是三价的）在 2017-2018 年针对甲型流感和乙型流感的效果，当时 A (H3N2) 和 B/Yamagata（仅存在于四价疫苗中）占主导地位。我们回顾性研究了 4-64 岁北加州凯撒永久居民感染 PCR 确诊的甲型流感和乙型流感的风险。我们估计了细胞培养疫苗与鸡蛋疫苗的相对 VE (rVE)，以及每种疫苗在接种疫苗和未接种疫苗个体之间的绝对 VE (aVE)。分析使用了带有日历时间线的 Cox 回归，按出生年份分层，并根据人口统计学、合并症和利用率进行了调整。三分之一（1,016,965/3,053,248）的人口接种了疫苗；932,545 人（占接种人数的 91.7%）接种了鸡蛋疫苗，84,420 人（占接种人数的 8.3%）接种了细胞培养疫苗。针对甲型流感的 rVE 为 8.0%（95% CI：-10, 23）；细胞培养疫苗的 aVE 为 31.7%（CI：18.7, 42.6），鸡蛋疫苗的 aVE 为 20.1%（CI：14.5, 25.4）。针对乙型流感的 rVE 为 39.6%（CI：27.9, 49.3）；细胞培养疫苗的 aVE 为 40.9%（CI：30，50.1），而鸡蛋基三价疫苗的 aVE 为 9.7%（CI 3.5，15.6）。在四价细胞疫苗中加入 B/Yamagata 谱系可更好地预防乙型流感，但细胞培养疫苗和鸡蛋基疫苗对甲型流感的疫苗效力都很低。改进流感疫苗需要持续进行疫苗效力比较监测。
培养的野猪细胞 科学备忘录
• 用于建立细胞系的细胞最初是从家养约克夏猪的皮下腹部脂肪组织活检中分离出来的。分离的细胞使用已验证其预期用途的标准方法（包括显微镜检查）进行表型鉴定。• 细胞系是通过选择性培养贴壁细胞，使其从含血清培养基生长到无血清培养基，经过几代（传代）培养而建立的。使用猪特异性聚合酶链式反应 (PCR) 检测来验证物种身份，并通过核型分析（正常染色体扩散）来评估遗传稳定性。• 细胞的培养方式如下：首先在贴壁培养增殖期增加细胞总数，然后进入细胞育肥期，在此阶段，细胞在特定培养基因子的诱导下形成细胞内脂滴。• 通过添加收获液分离细胞、离心、清洗，并在温控环境下储存在无菌容器中。 • 清洗后收获的材料被描述为培养的猪肉（Sus scrofa domesticus）脂肪细胞，其脂肪酸含量与传统猪肉脂肪产品相似。并提供了微生物、毒性重金属和微量金属的规格。• 我们评估了有关细胞系、生产工艺（包括建立细胞库）、生产过程中使用的物质以及收获的细胞材料特性的信息，包括可披露的安全叙述中提供的信息以及补充保密材料中支持性佐证信息。• 根据 CCC 000008 中提供的数据和信息，我们目前对 Mission Barns 的结论没有任何疑问，该结论认为，由 CCC 000008 中定义的生产工艺产生的培养猪肉脂肪细胞材料构成或含有该材料的食品与通过其他方法生产的同类食品 1 一样安全。此外，我们尚未发现任何信息表明所述生产工艺
流感疫苗指南 - 提交和程序要求
- 传代水平 - 血凝素和神经氨酸酶的特性 - 分析方案（包括种子批次的测试结果）* 3.2.S.2.4 关键步骤和中间体的控制 3.2.S.2.5 工艺验证和/或评估 - 单价批量： - 生产工艺菌株的具体变化 - 关键生产步骤的验证（新菌株） 1. 灭活 2. 分裂效率 3.2.S.3 特性（特性研究的选择，如粒度分布、聚集体的存在等） 3.2.S.4.1 规范（表格格式的已批准规范的副本） 3.2.S.4.2 分析程序 3.2.S.4.3 分析程序的验证（新菌株的 SRD 测试验证） 3.2.S.4.4 单价批量的批次分析结果：来自新主菌株的每个工作种子批次的前三个单价批量的结果（包括神经氨酸酶测试）新菌株的种子批次 - 每个工作种子批次均来自先前批准的主种子批次，其中工作种子批次的制备程序与批准的程序不同 3.2.S.7 药物物质：稳定性（活性物质的稳定性测试：使用一年以上的单价散装的结果）3.2.P.1 成分 3.2.P.2.2.1 药物开发：配方开发（实际配方（新季节菌株）和如果已要求临床试验来支持“年度”更新，则提供临床试验中使用的批次分析证书（如有）（第一步或第二步提交）3.2.P.3.2 批次配方（实际配方）3.2.P.5.1 规格（以表格形式复制批准的规格和常规测试分析方法）3.2.P.5.3 分析程序的验证；对新菌株进行 SRD 测试验证（使用三价散装或药物产品）3.2.P.8 药物产品：稳定性 - 上一季的稳定性数据 - 稳定性承诺 - 最终批次的批准后稳定性方案稳定性
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
多重荧光原位杂交 (M-FISH) 揭示 HAP1 细胞系中的染色体不稳定性 (CIN)
摘要背景：HAP1 是一种近单倍体人类白血病癌细胞系，常与 CRISPR-Cas9 基因编辑技术结合用于基因筛选。HAP1 携带费城染色体 (Ph) 和插入 19 号染色体的额外的约 30 Mb 的 15 号染色体片段。体外细胞系作为生物医学研究模型系统的潜在用途取决于其维持基因组稳定性的能力。作为一种具有近单倍体基因组的癌细胞系，HAP1 容易出现遗传不稳定性，而其在培养中自发二倍化的倾向进一步加剧了这一问题。此外，CRISPR-Cas9 基因编辑加上长时间的体外细胞培养可能会诱发意外的“脱靶”细胞遗传学突变。为了深入了解染色体不稳定性 (CIN) 和核型异质性，使用多重荧光原位杂交 (M-FISH) 在单细胞分辨率下对 19 个 HAP1 细胞系进行了细胞遗传学表征，其中 17 个为近单倍体，两个为双单倍体。我们重点研究了新的数值 (N) 和结构 (S) CIN，并讨论了观察到的不稳定性的潜在致病因素。对于每个细胞系，我们检查了其倍性、基因编辑状态和体外细胞培养时间。结果：19 个细胞系中有 16 个已经过基因编辑，传代次数从 10 到 35 不等。17 个近单倍体细胞系的二倍体化范围为 4% 到 35%，[1n] 和 [2n] 中期的 N- 和 S-CIN 百分比范围为 7% 到 50%，两个细胞系没有显示 CIN。两种双单倍体细胞系中患有 CIN 的细胞百分比分别为 96% 和 100%。观察到的最常见的 S-CIN 是缺失，随后是非相互易位和罗伯逊易位。有趣的是，我们观察到近单倍体和双单倍体细胞系中都普遍存在与 13 号染色体相关的 S-CIN，且涉及 13 号染色体的罗伯逊易位发生率很高。此外，基因座特异性 BAC（细菌人工染色体）FISH 使我们首次能够显示额外的 15 号染色体片段插入到 HAP1 基因组 19 号染色体的 p 臂而不是 q 臂中。结论：我们的研究揭示了 CIN 的高发生率，导致大多数 HAP1 细胞系的核型异质性，并且细胞系之间的染色体畸变数量有所不同。值得注意的观察是与 13 号染色体相关的结构染色体畸变频率很高。我们表明，CRISPR-Cas9 基因编辑技术与自发二倍体化和长期体外细胞培养相结合，可能有助于在现有 CIN 的 HAP1 细胞系中诱导进一步的染色体重排。
来自芥菜 (Brassica juncea (L.)) 愈伤组织的体外器官发生...
2 兰契大学植物学系，兰契，贾坎德邦，印度 3 兰契大学植物学系生物技术硕士，兰契大学植物学系，印度贾坎德邦 4 兰契大学植物学系生物技术硕士，兰契大学植物学系，印度贾坎德邦 摘 要 本研究旨在建立一种优化的印度芥菜 (L.) Czern & Coss. (芥菜) 不同部位的体外愈伤组织诱导和增殖方案。将叶和茎外植体培养在补充了各种生长素和细胞分裂素浓度的 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基中，以获得愈伤组织形成的最佳生长条件。所测试的激素组合包括 0.5、1 和 2 mg/L 的吲哚-3-乙酸 (IAA)、0.5、1 和 2 mg/L 的苄氨基嘌呤以及 0.5、1 和 2 mg/L 的 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)。基于愈伤组织诱导频率，在不同时期和光照、温度和湿度培养条件下，对叶片和茎外植体产生的愈伤组织进行三次重复评估。在以 1:1 的比例补充 BAP 和 2,4 D 的 MS 培养基中，将叶片作为外植体的结果显示，接种 45 天后愈伤组织诱导率最高，这是独一无二的。茎外植体接种 45 天后，在激素浓度 BAP:IAA（0.5:1）下产生愈伤组织。这些产生的愈伤组织显示出明显的伸长和良好的叶片形状。未分化愈伤组织增生、变绿并形成成熟芽凸显了愈伤组织的有效性。继代培养后，愈伤组织的习惯化和持续传代使得培养基中无需添加细胞分裂素。愈伤组织获得细胞分裂素，导致出芽和营养器官发育。反过来，这些细胞允许器官发生，成熟植物成功再生。这种可重复的方案可用于愈伤组织诱导和植物再生，这是植物育种或生物技术应用（包括用于作物改良的基因转化）的重要工具。此外，通过既定的方案，对芥菜组织中植物激素之间相互作用的认识得到了提高。 关键词：愈伤组织、再生、生长素、作物、BAP、器官发生、芥菜 (L.) 1. 引言 在植物组织培养中，愈伤组织发生和器官发生是基因转化和作物发育所必需的过程。这些程序中的一个关键阶段是有效的愈伤组织诱导，它为以后的再生和转化提供所需的细胞材料。先前的研究表明，为了在不同芸苔属植物中获得较高的愈伤组织诱导率和植物再生，优化植物激素浓度至关重要（Gupta & Chaturvedi，2021 年；Singh 等人，2020 年）。大多数人称之为印度芥菜，Brassica juncea (L.) Czern. & Coss。是一种广泛种植的油籽作物，其油料和叶类蔬菜对经济十分重要。
在轨道上生产病毒：轨道震荡病毒疫苗制造的最新进展
关键词：轨道式振荡生物反应器 (OSB)、禽类 AGE1.CR.pIX 悬浮细胞、流感病毒、动物疱疹病毒、腺相关病毒 (AAV)、人胚胎肾 (HEK) 293 细胞、一次性灌注至高细胞密度、制造。悬浮细胞的预培养在摇瓶中成功完成。特别是新开发的设计细胞在高摇动频率下在摇瓶中传代多达 100 次，然后完美适应在具有 pH 控制和最大氧气供应（通常高于 80% pO 2 ）的 CO 2 培养箱中生长。当它们随后被转移到搅拌槽生物反应器进行扩大时，特定细胞生长率通常较低，并且细胞对通过酸/碱添加和由于潜水器放气（气泡）而产生的剪切应力的 pH 控制变得敏感。禽类 AGE1.CR.pIX 和人类 HEK 293 细胞也出现了这种情况。为了避免这些问题，评估了在振荡模式下的扩大规模。这里我们介绍了 SB10-X OSB 生物反应器在袋子设计和控制单元改进方面的最新进展。引入了一种新的控制策略，从而可以更快、更精确地控制 pH 和 DO。此外，还优化了灌注袋，以便可以轻松连接一个或两个 TFF ATF 系统。这两项发展都带来了更强大的 SB10-X 系统，可以轻松执行批量、补料分批或灌注运行。在 10 L 一次性标准袋中，在化学定义的培养基 CD-U3（Biochrom-Merck，德国）中以 70 rpm 的摇动频率培养 Avian AGE1.CR.pIX 细胞（ProBioGen AG，德国）。对于灌注，使用了交替切向流系统（ATF2，Repligen，500 kDa 截止值）。感染流感病毒 A/PR/8/34 (H1N1) 后，MOI 为 0.001，工作体积从 5 升增加到 9 升，同时保持灌注。使用不同的填充体积评估 25 和 50 x 10 6 细胞/毫升的细胞浓度，以了解顶部空间通气的影响。总体而言，可以获得 3500 个病毒体/细胞的非常高的细胞特异性病毒产量，导致 HA 滴度高达 3.7 log 10（HA 单位/100 µL），感染滴度高达 8.8 x 10 9 TCID 50 /毫升。基于重组 AAV 的载体不仅是基因治疗目的的合适载体，而且还能够诱导针对各种抗原的强烈、主要是细胞的免疫反应。到目前为止，AAV 生产主要使用瞬时转染的贴壁人类 HEK 293 细胞（例如在细胞堆栈中），这对大规模 AAV 生产来说是一个重大挑战。在这里，我们测试了内部适应悬浮生长的 HEK 293 细胞，以通过一种允许简单扩大规模的过程生产 AAV9 的能力。因此，HEK 293 悬浮细胞在 5 L 化学定义的无血清培养基中培养，细胞密度为 1 x 10 6 个细胞/毫升，使用 SB10-X OSB 生物反应器，摇动频率为 65 rpm。24 小时后以 70 rpm 的振荡频率进行聚乙烯亚胺 (PEI) 介导的三重转染（包括 GFP 报告基因）。最后，转染后 48 小时，收获细胞和上清液进行 AAV 分离，并测定裂解物中 DNase I 抗性载体颗粒 (DRP) 的数量。由于转染效率高（基于 GFP 报告基因的转染率 >90%）且 SB10-X 系统中整个批处理过程性能良好，因此达到了 1.4 x 10 12 DRP/ml 或 7 x 10 15 DRP/批（5 L）范围内的制造相关 AAV 滴度。总之，在轨道上生产病毒可能是创新疫苗制造的一种有吸引力的替代方案。