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无需供体 DNA 模板，CRISPR/FnCas12a 介导的细菌植物病原体高效多重和迭代基因组编辑
1 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京，2 农业农村部桂林农作物害虫科学观测实验站，桂林，3 中国农业科学院作物科学研究所，国家农作物基因资源与遗传改良重大科学研究设施，北京，4 南京农业大学，植物病虫害监测与治理教育部重点实验室，南京，5 上海交通大学农业与生物学院，微生物代谢国家重点实验室，上海，6 浙江大学生物技术研究所，水稻生物学国家重点实验室，杭州，
推出 CRISPR/Cas9 胞嘧啶碱基编辑器工具箱“LeishBASEedit”——无需 DNA 双链断裂、同源重组或供体 DNA 即可对利什曼原虫进行基因编辑和高通量筛选
。CC-BY-NC 4.0 国际许可证永久有效。它是在预印本（未经同行评审认证）下提供的，作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。此版本的版权持有者于 2022 年 12 月 8 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.12.08.519658 doi：bioRxiv 预印本
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
使用长单链寡核苷酸供体在秀丽隐杆线虫中高效地进行 CRISPR/Cas9 介导的大型插入
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 9 月 27 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.09.26.509570 doi：bioRxiv 预印本
使用合成的同源供体构建体进行 CRISPR 介导的同源重组，为果蝇基因标记提供扩展工具包
摘要 之前，我们描述了大量果蝇菌株，每个菌株都携带一个人工外显子，其中包含一个基于 CRISPR 介导的同源重组插入目标基因内含子中的 T2AGAL4 盒。这些等位基因可用于多种应用，并且已被证明非常有用。最初，基于同源重组的供体构建体具有较长的同源臂（>500 bps），以促进大型构建体（>5 kb）的精确整合。最近，我们表明，供体构建体的体内线性化使得能够使用短同源臂（100-200 bps）将大型人工外显子插入内含子中。较短的同源臂使得商业合成同源供体成为可能，并最大限度地减少了供体构建体生成的克隆步骤。不幸的是，大约 58% 的果蝇基因缺乏适合所有注释异构体中人工外显子的编码内含子整合。在这里，我们报告了新构建体的开发，这些构建体允许用 KozakGAL4 盒替换缺乏合适内含子的基因的编码区，从而产生与目标基因类似地表达 GAL4 的敲除/敲入等位基因。我们还开发了定制载体骨架，以进一步促进和改善转基因。在包含目标基因 sgRNA 的定制质粒骨架中合成同源供体构建体，无需注射单独的 sgRNA 质粒，并显著提高了转基因效率。这些升级将使几乎所有果蝇基因都能靶向，无论外显子-内含子结构如何，成功率为 70-80%。
药物设计中的氢键供体
a请参阅clogpalk.param.2.0（参数）和clogpalk.vbind.2.0（智能定义的向量绑定）[48]的补充信息中的文本文件，以通过Slope参数在Smarts中获得与非溶剂原子的数量相乘。b从Q（2.7;表2）用于二甲基苯胺从Q（3.8）中使用MSA（120Å2）和六烷基/水logP（-0.04）[59]的Q（1）计算为苯胺的Q（3.8）[59]。c从表1。D值未归一化，因为HBD子结构中的氢原子数量未归一化。e值适用于2-（3-苯佐羟丙基）-Imidazole
使用TALEN，CRISPR-CAS9和CRISPR-CAS12A与AAV6同源性供体组合恢复XLP
X连接的淋巴细胞增生性疾病是一种罕见的遗传免疫疾病，是由SH2D1A基因中的突变或缺失引起的，它编码了细胞内适配器蛋白SAP（SLAM相关蛋白）。SAP对于介导多种关键免疫过程至关重要，并且在缺失的情况下，免疫系统（尤其是T细胞）失调。患者出现了各种临床表现，包括淋巴淋巴细胞增多症（HLH），肿瘤性肿瘤性血症，淋巴瘤和自身免疫性。治疗选择是有限的，患者很少能够在成年中生存，而没有同种异体造血干细胞移植（HSCT）。但是，此过程在不匹配的供体设置中或在有活跃的HLH的情况下会产生较差的结果，从而剩下未满足的临床需求。自体造血干细胞或T细胞疗法可以提供替代的治疗选择，从而消除了为HSCT找到合适的供体的需求，并具有出现同质性的任何风险。SAP具有严格控制的表达方式，即常规的慢病毒基因输送平台可能无法完全复制。一种基因编辑方法可以保留更多控制SAP表达的内源性调节元素，并可能提供更佳的治疗。在这里，我们评估了使用Adeno相关的Serotype 6（AAV6）基于供体模板的adeno相关病毒血清型6（AAV6）的载体，可以在SH2D1A基因座的第一个外显子上推动SAP cDNA的靶向插入SH2D1A基因座的第一个外显子的能力。所有核酸酶平台均能够具有高效率基因编辑，并使用无血清AAV6转导方案进行了优化。我们表明，通过基因编辑工具纠正的XLP患者的T细胞恢复了SAP基因表达的生理水平并恢复了SAP依赖性免疫功能，这表明XLP患者具有新的治疗机会。
南非国家数字和未来技能战略实施方案 - 为青年提供体面工作
API 应用程序编程接口 BBI 宽带基础设施 BPS 基本支持包 CAT 计算机应用技术 CDW 社区发展工作者 CfE 关爱教育 CHE 高等教育委员会 CHW 社区卫生工作者 CIDA 社区个人发展协会 COGTA 合作治理和传统事务部 CPSI 公共服务创新中心 CWD 残疾儿童 CWP 社区工作计划 DBE 基础教育部 DCDT 通信和数字技术部 DDF 数字发展基金 DEL 就业和劳工部 DHA 内政部 DHET 高等教育和培训部 DHP 数字中心计划 DISA 南非残疾人信息 DoH 卫生部 DPSA 公共服务和行政部 DRLR 农村发展和土地改革部 DSAC 体育、艺术和文化部 DSBD 小型企业发展部 DSC 数字技能中心 DSD 社会发展部（DSD） DSF 数字技能论坛 DSI 科学与创新部 DTIC 贸易、工业和竞争部 DWYPD 妇女、青年和残疾人部 ECD 早期儿童发展 EIG 教育基础设施补助金 EMIS 教育管理信息系统 EPWP 扩大公共工程计划 ETDP-SETA 教育和培训部门 教育培训局 GCIS 政府通信和信息服务 GDP 国内生产总值 GITOC 政府信息技术官员委员会 GTAC 政府技术咨询中心 HEIs 高等教育机构 HEMIS 高等教育管理信息系统 HWSETA 卫生和福利部门 教育培训局 ICASA 南非独立通信管理局 IEG 基础设施和效率补助金
IDT_使用 Alt-R CRISPR Cas9 系统和 HDR 供体寡核苷酸进行同源性定向修复快速参考指南 (RUO21-0213_002 02/22)
30 多年来，IDT 的创新基因组学应用工具和解决方案一直在推动进步，激励科学家敢于梦想，实现下一个突破。IDT 开发、制造和销售核酸产品，为学术和商业研究、农业、医疗诊断和药物开发等领域的生命科学行业提供支持。我们拥有全球业务，提供个性化的客户服务。
六方氮化硼中的供体-受体对量子发射体
摘要：从量子传感到量子计算，量子发射器在众多应用中必不可少。六方氮化硼 (hBN) 量子发射器是迄今为止最有前途的固态平台之一，因为它们具有高亮度和稳定性以及自旋-光子界面的可能性。然而，对单光子发射器 (SPE) 的物理起源的理解仍然有限。在这里，我们报告了整个可见光谱中 hBN 中的密集 SPE，并提出证据表明大多数这些 SPE 可以通过供体-受体对 (DAP) 很好地解释。基于 DAP 跃迁生成机制，我们计算了它们的波长指纹，与实验观察到的光致发光光谱非常匹配。我们的工作为物理理解 hBN 中的 SPE 及其在量子技术中的应用迈出了一步。关键词：六方氮化硼、单光子发射器、供体-受体对、量子光学■简介