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World File Search System定向进化
加州大学欧文分校
通过在体内大规模地同时进行超突变和选择，微生物宿主中的酶和其他蛋白质的连续定向进化能够超越经典定向进化，并且只需极少的手动输入。如果目标酶的活性可以与宿主细胞的生长相结合，那么只需选择生长就可以提高活性。与所有定向进化一样，连续版本不需要事先了解目标的机制。因此，连续定向进化是修改植物或非植物酶以用于植物代谢研究和工程的有效方法。在这里，我们首先描述用于连续定向进化的酵母（酿酒酵母）OrthoRep 系统的基本特征，并将其与其他系统简要比较。然后，我们将逐步介绍使用 OrthoRep 进化主要代谢酶的三种方式，并以 THI4 噻唑合酶为例并说明获得的突变结果。最后，我们概述了 OrthoRep 的应用，这些应用满足了日益增长的需求：（i）改变植物酶的特性以便返回植物；（ii）改造（“植物化”）原核生物（尤其是外来原核生物）的酶，使其在温和的类植物条件下发挥良好作用。
通过定向进化和计算建模构建富含 sp3 的多环化合物的生物催化策略
利用工程酶进行催化为活性药物的生产提供了更有效的途径。然而，生物催化在早期药物发现活动中的潜力仍未得到充分开发。在这项研究中，我们开发了一种生物催化策略，通过苯并噻吩和相关杂环的分子内环丙烷化来构建富含 sp 3 的多环化合物。我们进化出了两种具有互补区域异构体选择性的卡宾转移酶，以催化在杂环的 C2 或 C3 位上带有重氮酯基的苯并噻吩底物的立体选择性环化。我们通过结合晶体学和计算分析阐明了这些反应的详细机制。利用这些见解，可以将其中一种生物催化剂的底物范围扩大到包括以前不反应的底物，这凸显了整合进化和理性策略来开发用于新自然转化的酶的价值。这里获得的分子支架具有三维和立体化学复杂性以及“三元律”特性的组合，这使得它们对于基于片段的药物发现活动具有很高的价值。
合成生物学在定向进化中的应用以增强酶催化效率Wenzhong Huang
抽象的合成生物学和定向进化是现代生物技术的最前沿，为提高工业应用的酶催化效率提供了前所未有的机会。这项研究提供了这些领域的全面概述，首先是对合成生物学原理和定向进化的基本原理的介绍，强调了它们在改善酶性能方面的重要性。我们探讨了有向进化的各种方法，包括随机和位置定向的诱变技术和高通量筛选方法，这对于鉴定具有出色催化特性的变体至关重要。该研究还深入研究了彻底改变了定向进化的合成生物学工具，例如CRISPR/CAS系统，重组DNA技术和用于酶设计的计算工具。通过详细的案例研究，我们突出了这些方法在增强生物燃料生产，药物合成，食品行业应用和环境生物修复方面的成功应用。讨论扩展到酶工程的最新进展，展示了催化效率提高的显着成就以及合成生物学与定向进化的整合。我们还解决了该领域的挑战和局限性，包括技术障碍，可伸缩性问题和道德考虑。最后，我们概述了未来的观点，专注于基因组编辑和人工智能等新兴技术，这些技术具有进一步推进酶工程的潜力。这项研究以对合成生物学的未来和工业生物技术的指导进化的长期目标和意义的反思结束。关键词合成生物学；定向进化；酶催化效率；蛋白质工程；工业生物技术
设计具有新功能的生物催化剂的策略
酶的一个重要特征是其高度的可工程化性，这一特征促成了酶的广泛应用。得益于先进的酶工程方法，我们在开发生物催化过程时不再局限于天然酶。相反，现在可以调整酶的特性以满足目标应用的特定要求。7 例如，可以对酶进行工程改造以扩大底物范围、改变选择性、改善动力学参数或增强工艺条件下的稳定性。这种工程改造通常通过定向进化来实现，定向进化已被证明是一种非常强大且通用的定制酶特性的策略。8,9 在某些情况下，定向进化与计算工具结合使用，以更有效地导航序列空间，并减少酶工程过程中的筛选负担。10,11
通过人工智能引导的定向进化筛选创建对病毒具有高亲和力的 ACE2 突变体
2. Ikemura N、Taminishi S、Inaba T、Arimori T、Motooka D、Katoh K、Kirita Y、Higuchi Y、Li S、Suzuki T、Itoh Y、Ozaki Y、
定向进化高活性整合酶以实现转基因位点特异性插入
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2024 年 6 月 11 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.06.10.598370 doi：bioRxiv 预印本
利用随机多路复用 sgRNA 组装碱基编辑器进行定向进化水稻基因
摘要 基于 CRISPR 的定向进化是一种有效的育种生物技术，可改善植物的农艺性状。然而，使用单个单向导 RNA 其基因多样化仍然有限。我们在这里描述了一种多重正交碱基编辑器 (MoBE) 和一种随机多重 sgRNA 组装策略，以最大化基因多样化。MoBE 可以在不同的靶标上有效诱导正交 ABE (< 36.6%)、CBE (< 36.0%) 和 A&CBE (< 37.6%)，而 sgRNA 组装策略将各种靶标上的碱基编辑事件随机化。对于水稻乙酰辅酶 A 羧化酶 (OsACC) 第 34 外显子的每一条链上的 130 个和 84 个靶标，我们在随机双 sgRNA 和随机三重 sgRNA 文库中观察到多达 27 294 种靶标-支架组合类型。我们进一步利用MoBE和随机双sgRNA文库对水稻中的OsACC进行了定向进化，获得了更强的除草剂抗性的单突变或连锁突变。这些策略可用于功能基因的原位定向进化，并可能加速水稻性状改良。
通过定向进化和计算建模构建富含 sp3 的多环化合物的生物催化策略
在 MD 轨迹中，分子重新定向，使得噻吩环位于血红素环 C 上方（1a 中为环 B），并且甲氧基的极性氧原子指向溶剂（图 6c）。相反，使用 6Me 取代的底物（2j）的 MD 模拟显示苯并噻吩环深深嵌入酶口袋中并远离溶剂（图 6c），其构象与底物 1a 和 5-OMe 底物不同。通过实验，酶对这些底物的活性遵循 2f（5-OMe）> 1a> 2j（6-Me）的顺序（图 3a）。由于该趋势与 MD 模拟确定的相应 TS 中苯并噻吩环对溶剂的暴露程度相关，我们假设底物
合成生物学在定向进化中的应用以增强酶催化效率Wenzhong Huang
抽象的合成生物学和定向进化是现代生物技术的最前沿，为提高工业应用的酶催化效率提供了前所未有的机会。这项研究提供了这些领域的全面概述，首先是对合成生物学原理和定向进化的基本原理的介绍，强调了它们在改善酶性能方面的重要性。我们探讨了有向进化的各种方法，包括随机和位置定向的诱变技术和高通量筛选方法，这对于鉴定具有出色催化特性的变体至关重要。该研究还深入研究了彻底改变了定向进化的合成生物学工具，例如CRISPR/CAS系统，重组DNA技术和用于酶设计的计算工具。通过详细的案例研究，我们突出了这些方法在增强生物燃料生产，药物合成，食品行业应用和环境生物修复方面的成功应用。讨论扩展到酶工程的最新进展，展示了催化效率提高的显着成就以及合成生物学与定向进化的整合。我们还解决了该领域的挑战和局限性，包括技术障碍，可伸缩性问题和道德考虑。最后，我们概述了未来的观点，专注于基因组编辑和人工智能等新兴技术，这些技术具有进一步推进酶工程的潜力。这项研究以对合成生物学的未来和工业生物技术的指导进化的长期目标和意义的反思结束。关键词合成生物学；定向进化；酶催化效率；蛋白质工程；工业生物技术
体内超突变和持续进化
在整个生命历史中，进化依赖于随机突变和自然选择的基本过程，从而产生了具有显著功能的多种生物分子。定向进化领域长期以来一直试图利用进化的力量来设计新的生物分子功能 1、2。然而，典型的细菌、酵母或人类细胞中 DNA 复制的突变率为每个碱基 10 −10 –10 −9 个替换 3 ，或者说，平均长度（~1 kb）的基因内的突变大约每 100 万到 1000 万次细胞分裂就会发生一次。在如此低的突变率下，即使是简单的单个突变也很难采样到，而这些突变可以使目标基因（GOI）及其编码的 RNA 或蛋白质朝着所需功能的方向发展。定向进化传统上转向体外多样性生成，其中可以使用易错 PCR 或随机寡核苷酸池对 GOI 施加高突变率 2 。然后将得到的GOI变体文库转化为细胞，在细胞中以RNA和蛋白质的形式表达，并进行选择或筛选。富集的GOI变体作为下一轮体外多样化、转化和选择或筛选的模板，推进进化周期（图1a）。尽管定向进化彻底改变了生物分子工程——特别是荧光蛋白、酶和抗体工程2、4——但它对手动分阶段进化步骤的传统依赖限制了进化搜索的深度和规模。由于需要体外GOI多样化，经典的定向进化放弃了