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World File Search System无标记
化脓性链球菌 Cas9 核糖核蛋白递送，用于在锥虫和利什曼原虫中进行高效、快速和无标记的基因编辑
图 1 布氏锥虫 PCF 中的 GFP 失活。（a）对组成性表达胞浆 eGFP 的布氏锥虫进行荧光流式细胞术分析。在用 20 μ g（无 Cas9、Cas9/gRNA GFP1、Cas9/gRNA GFP2、Cas9/gRNA GFP3）或 60 μ g（Cas9/gRNA GFP2）来自 IDT 的 RNP 复合物转染后 24 至 72 小时随时间监测 GFP 荧光，条形图显示用不同向导转染后 72 小时 GFP 阴性细胞的百分比（n = 3）。采用 Prism 软件进行统计分析，采用 t 检验（非配对、正态分布、参数检验和双尾）。显着性水平（p 值）用星号表示。 （b）上图显示了允许 e Sp Cas9 在大肠杆菌中表达的质粒的示意图。蓝色框表示蛋白质 N 端和 C 端的两个多组氨酸序列，红色框表示 TEV 和肠激酶 (EK) 蛋白酶的切割位点，灰色框表示三个核定位信号 (NLS)，黑色框表示 FLAG 表位的三个重复，橙色框表示 e Sp Cas9 编码序列。下图显示了在用来自 IDT 或实验室纯化 (Lab) 的 RNPs 复合物 (无 Cas9、20 μ g Cas9/gRNA GFP2、40 μ g Cas9/gRNA GFP2、40、60 和 80 μ g Cas9/gRNA GFP2) 转染后 72 小时监测的表达 GFP 的 T. brucei 的荧光流式细胞术分析。（c）不再表达 GFP 的克隆中 GFP 基因的一部分的序列比较。该序列仅显示 GFP2 向导 RNA 所针对的区域。灰色框（H1 和 H2）突出显示可能用于 MMEJ 修复的同源区域。由实验室纯化的 Cas9 失活产生的序列和来自商业 Cas9 的序列分别标记为 Lab 和 IDT。下面显示了 Dc6 和 Ba10 克隆的相应色谱图（置信区间 95%— p 值样式：0.1234 (ns)；0.0332 (*)；0.0021 (**)；0.0002 (***)；< 0.0001 (****)）。
具有无标记探针
胃癌是全球与癌症相关死亡的第二大主要原因。早期诊断显着增加了生存的机会；因此，需要改进的辅助探索和筛选技术。以前，我们通过将光学探针插入仪器通道中使用了增强的多光谱内窥镜。然而，有限的视野和在组织上留下的光学活检留下的标记使探测的可疑区域的导航和重新访问变得复杂。在这项贡献中引入了两种创新工具，以显着提高临床实践中患者的可追溯性和监测：（i）视频镶嵌以建立对大型胃区域的更全面和全景的视野； （ii）具有内镜图像的靶向和注册的光学活检。所提出的基于光流的镶嵌技术选择了最小化纹理不连续性的图像，尽管缺乏纹理和照明变化，但仍有坚固的不连续性。光学活检的靶向基于内窥镜视图中自由标记探针的自动跟踪，使用深度学习在探索过程中动态估算其姿势。假设器官的小目标区域几乎是平坦的，姿势估计的精度足以确保标准白光颜色图像和高光谱探针图像的精确重叠。这允许将所有时空跟踪的活检位点映射到全景镶嵌上。从医院的患者获得的视频中进行了实验验证。所提出的技术纯粹是基于软件的，因此很容易地整合到临床实践中。它也是通用的，并且与连接到圆柱纤维镜连接的任何成像方式兼容。
使用细胞FAD自动荧光作为无标记的细胞属性，用于产生嵌合抗原受体-T细胞
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已成为治疗血液恶性肿瘤的一种有吸引力的方法。但是，这种疗法的可访问性受到复杂制造工艺，有限的制造设施能力以及高技能劳动力的要求，以进行CAR-T细胞生产的手动步骤。为了最大程度地减少手动过程，CAR-T细胞制造场正在向封闭和自动化系统转移，包括分析工具，可提供对生产中细胞的间歇性监测的分析工具。因此，需要在封闭系统中密切监测CAR-T细胞的无标签技术。在这里，我们评估了配备了405nm紫罗兰色激光器的流式细胞仪的使用，用于研究T细胞中NADH和FAD自动荧光。我们的结果表明，NADH和FAD自动荧光的增加与T细胞激活标记，CD25的上调显着相关，并且在T细胞激活后的头三天，在消费培养基中的细胞外乳酸的增加。我们通过建立CAR-T细胞中FAD的平均荧光强度（MFI）的变化速率与使用G-Rex Biorx Biorextor的T细胞增殖速率之间的变化速率之间的关系来确定CAR-T细胞生产的终点的潜在用途。共同表明，自动荧光，尤其是FAD自动荧光，可以用作无标记的生物标志物（细胞属性），用于监测CAR-T细胞生产过程中T细胞激活和扩张。使用405nm可见光代替了遗传毒性紫外线波长来评估NADH和FAD自动荧光，为将自动荧光测量结果铺平了一种方式，以将自动荧光测量纳入封闭和自动化的系统中，以用于对CAR-T细胞制造的过程中的监测。
AI-Smartphone无标记运动捕获反转跳动期间髋关节，膝盖和踝关节运动学的运动
f i g u r e 1 Vicon标记（前后）用于反射标记（A）：右前头部RFHD，左前头部LFHD，左后头LBHD，左后头LBHD，右后头RBHD，Clavicle Clav，Clavicle Clav，Clavicle clav，serternum strn，c7，C7，C7，C7，c7 LWRA/LWRB, Left Finger LFIN, Right Shoulder RSHO, Right Upper Arm RUPA, Right Elbow RELB, Right Forearm RFRM, Right Wrist RWRA/RWRB, Right Finger RFIN, Left ASIS LASI, Left PSIS LPSI, Right ASIS RASI, Right PSIS RPSI, Left thigh LTHI, Left Knee LKNE, Left Tibia LTIB, Left Ankle LANK, Left脚跟Lhee，左脚趾ltoe，右大腿Rthi，右膝盖rkne，右胫骨rtib，右脚踝等级，右脚跟Rhee和右脚趾rtoe； SBSQ置（B）的标记模型由24个解剖键组成组成，结合成骨骼模型：0：骨盆中心，1：中心左髋关节，2：右臀部中心臀部，3：下脊柱，4：左膝盖中心，4：左膝盖，5：右膝盖的中心，6：中心，7：中心，7：左中间：左左：左：左：左：左：8：左：脚趾，11：右脚趾的中心点，12：脖子，13：左锁骨中心点，14：右侧锁骨中心点，15：头部中心，中心，16：左肩关节中心：17：右肩关节中心，右肘接头，18：左肘接头中心，19：右肘中心，右肘关节中心，20：20：左手腕的中心：左手腕的中心，21：左手腕的中心，左右22：左侧的中心：左侧的右侧孔右侧和23：23：23：23：23：23：23：23：23：23：
无标记数据的替代建模的深度自适应抽样
抽象的替代建模对于参数微分方程系统具有很大的实用性。与经典数值方法相反，使用基于物理学的深度学习方法为这种系统构造模拟器是一个有希望的方向，因为它具有处理高维度的潜力，这需要最大程度地减少训练的随机样本损失。然而，随机样品引入了统计误差，这可能成为近似和高维问题的近似值的主要误差。在这项工作中，我们提出了一种深层自适应采样方法，用于对低规范性参数微分方程的替代建模，并说明了自适应采样的必要性以构建替代模型。在参数设置中，剩余损耗功能可以视为空间和参数变量的不均衡概率密度函数（PDF）。与非参数设置相反，可以使用分解的关节密度模型来减轻参数空间引起的困难。PDF通过深层生成模型近似，从中生成新样品并将其添加到训练集中。由于新样品与残留诱导的分布相匹配，因此重新定义的训练集可以进一步减少当前近似解决方案中的统计误差
高通量 PROTAC 化合物筛选工作流程，用于在 Orbitrap Astral 质谱仪上进行靶向蛋白质降解，并进行准确的无标记定量
靶向蛋白质降解 (TPD) 是药物发现中一种新兴的变革性策略，它利用细胞蛋白质降解过程来选择性消除有害蛋白质。通过实现与泛素化蛋白酶体系统的诱导接近，小分子促进致病蛋白质的降解，为以前所未有的精度和功效针对多种疾病靶向以前无法用药的蛋白质打开了大门 (图 1)。直接设计能够选择性促进诱导接近的化合物在实践中具有挑战性，因此具有可靠定量准确性的化合物筛选是 TPD 领域药物发现的关键阶段。需要对大量化合物进行准确定量筛选，这使得基于高通量质谱的工作流程成为确保准确鉴定先导化合物的不二选择。
无标记代谢成像增强嵌合抗原受体T细胞治疗的疗效
标题：无标记代谢成像增强嵌合抗原 1 受体 T 细胞治疗的疗效 2 3 作者： Dan L. Pham 1,2†、Daniel Cappabianca 1,3†、Matthew H. Forsberg 4、Cole Weaver 1,2、4 Katherine P. Mueller 5、Anna Tommasi 1,3、Jolanta Vidugiriene 6、Anthony Lauer 6、Kayla Sylvester 6、5 Madison Bugel 1,3、Christian M. Capitini 4,7、Krishanu Saha 1,3*、Melissa C. Skala 1,2* 6 7 附属机构： 8 1 威斯康星大学麦迪逊分校生物医学工程系；美国威斯康星州麦迪逊 9。 10 2 莫格里奇研究所；美国威斯康星州麦迪逊。 11 3 威斯康星大学麦迪逊分校威斯康星发现研究所；美国威斯康星州麦迪逊 12 4 威斯康星大学医学与公共卫生学院儿科系；13 美国威斯康星州麦迪逊。 14 5 宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院肿瘤学部儿科系；15 美国宾夕法尼亚州费城。 16 6 Promega 公司；16 威斯康星州菲奇堡。 17 7 威斯康星大学麦迪逊分校威斯康星大学卡博内癌症中心；17 美国威斯康星州麦迪逊。 18 20 † 这些作者对本文贡献相同 21 * 通讯作者：ksaha@wisc.edu ，mcskala@wisc.edu 22 23 摘要：24 25 嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法治疗实体瘤不仅因为免疫抑制肿瘤微环境具有挑战性，还因为其制造过程复杂且难以监控。制造直接影响 CAR T 细胞的产量、表型和代谢，这些与体内效力和持久性相关。特别是，尽管代谢适应性是一项关键的质量属性，但 T 细胞代谢需求在整个制造过程中如何变化仍未得到探索。在这里，我们使用光学代谢成像 (OMI) 解决了这一限制，这是一种基于自发荧光代谢辅酶 NAD(P)H 和 FAD 评估单细胞代谢的非侵入性、无标记方法。使用 OMI，我们确定了培养基组成相对于抗体刺激和/或细胞因子的选择对抗 GD2 CAR T 细胞代谢、活化强度和动力学以及表型的主要影响。我们证明 OMI 参数可以指示病毒转导和基于电穿孔的 CRISPR/Cas9 的细胞周期阶段和最佳基因转移条件。值得注意的是，在 37 无病毒 CRISPR 编辑的抗 GD2 CAR T 细胞模型中，OMI 测量可以准确 38 预测氧化代谢表型，从而产生更高的体内抗神经母细胞瘤效力。我们的数据支持 OMI 作为一种强大、灵敏的分析工具的潜力，可以识别 40 最佳制造条件并在整个制造过程中监测细胞代谢，从而提高 41 CAR T 细胞产量和代谢适应性。42 43
金纳米颗粒装饰的基于催化微动物的催化剂，用于快速电化学无标记的无淀粉样蛋白β42临床
摘要：微型运动（MM）技术在临床环境中提供了一种有价值且智能的自动生物传感微观方法，在阿尔茨海默氏病（AD）的情况下，样本可用性稀缺。可溶性淀粉样蛋白β蛋白低聚物（AβO）（AβO）（主要是AβO42），在生物流体中循环的循环已被认为是AD的分子生物标志物和AD的分子生物标志物和治疗靶标，因为它们的高毒性，并且与AD相比，它们与AD的相关性更强。基于电化学标记的氧化纳米颗粒（AUNP）/镍（Ni）/铂（Ni）/铂纳米颗粒（PTNPS）微型颗粒（MM GO - go-aunps） - 基于电化学标记的无电化学aptassay被提出，以进行敏感，准确的，临床的临床范围，例如，βO 42的临床范围较快，以下（CSF）和AD患者的血浆。 一种表示在MM电气合成期间仅在一个步骤中仅在一个步骤中的a unp的原位形成的方法（mm go -aunps）。 AβO42特异性硫醇化调子剂（APTAβOD 42）通过Au-s的相互作用固定在MM GO-AUNP中，从而可以选择性地识别AβO42（mm aunps-aunps-aunps-aunps-aunps-apt-apt app-app-apt aβoβoβob d 42-aβo d 42-aβoβo 42）。 aunps不仅被智能地用于共价结合特定的硫醇化运动剂，以设计无标签的电化学插图，而且还可以改善由于其催化活性（大约2.0×速度）而提高最终的MM推进性能。 值得注意的是，我们基于MM的Bioplatform证明了针对DOT印迹分析在目标样品中确定AβO42的竞争力，该分析需要超过14小时才能提供定性结果。基于电化学标记的氧化纳米颗粒（AUNP）/镍（Ni）/铂（Ni）/铂纳米颗粒（PTNPS）微型颗粒（MM GO - go-aunps） - 基于电化学标记的无电化学aptassay被提出，以进行敏感，准确的，临床的临床范围，例如，βO 42的临床范围较快，以下（CSF）和AD患者的血浆。一种表示在MM电气合成期间仅在一个步骤中仅在一个步骤中的a unp的原位形成的方法（mm go -aunps）。AβO42特异性硫醇化调子剂（APTAβOD 42）通过Au-s的相互作用固定在MM GO-AUNP中，从而可以选择性地识别AβO42（mm aunps-aunps-aunps-aunps-aunps-apt-apt app-app-apt aβoβoβob d 42-aβo d 42-aβoβo 42）。aunps不仅被智能地用于共价结合特定的硫醇化运动剂，以设计无标签的电化学插图，而且还可以改善由于其催化活性（大约2.0×速度）而提高最终的MM推进性能。值得注意的是，我们基于MM的Bioplatform证明了针对DOT印迹分析在目标样品中确定AβO42的竞争力，该分析需要超过14小时才能提供定性结果。这种移动的生物术提供了快速（5分钟），选择性，精确（RSD <8％），并准确地定量βO42（回收率94 - 102％）具有出色的敏感性（LOD = 0.10 Pg ml - 1）和宽线性（0.5-500 pg ml-ml-inflof flastial flastial flastial flastial flastice） l），没有任何稀释。也重要的是要强调其对液体活检的潜在分析（作为等离子体和CSF样品的潜在分析），从而提高了诊断的可靠性，因为神经退行性疾病的异质性和时间复杂性。获得的出色结果证明了我们的方法作为临床/POCT（护理点测试）常规场景的未来工具的分析效力。■简介
肝炎病毒感染后猪肝蛋白质组的无标记定量分析
摘要：乙型肝炎代表了由乙型肝炎病毒（HEV）引起的一种新兴的人畜共患病，为此，主要的传播途径是食源性的。尤其是，人类感染与消耗被污染的猪起源未污染的未污染的肉有关。这项研究的目的是应用比较蛋白质组学来确定是否可以使用猪肝蛋白谱来区分HEV的猪血清阳性和血清凝性。初步地，使用ELISA评估136只动物的血清中抗HEV抗体的存在。在分析的样品中，估计的血清阳性为72.8％，也可以鉴定出10只动物，5个阳性和5个阴性，来自同一农场。此条件为均质动物之间的定量蛋白质组学比较创造了基础，在该动物中，只有与HEV的接触应代表区分因子。对所有肝脏渗出液样品中蛋白质组的分析导致两个实验组之间差异表达的554个蛋白质的鉴定，其中293个蛋白质在阳性样品中具有更大的丰度，而在阴性泄漏中则更多。途径富集分析使我们能够强调HEV与宿主生物系统之间相互作用在诱导69个途径的潜在富集中的影响。其中，碳代谢在41种蛋白质的参与中脱颖而出，这些蛋白质经过相互作用分析。这种方法使我们能够将注意力集中在参与糖酵解的三种酶上：6-磷酸葡萄糖异构酶（GPI），3-磷酸3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和果糖糖 - 双磷酸醛糖酶A（Aldoa）。因此，HEV感染似乎引起了该过程的加强，这涉及葡萄糖的分解，以获得对病毒生存有用的能量和碳残基。总而言之，通过与HEV的相互作用，无标签的LC-MS/MS方法在突出猪肝蛋白质组引起的主要差异方面显示出有效性，从而在识别宿主代谢上的病毒特征方面提供了重要信息。
无标记的非电源癌细胞...
基于CMOS的微电极阵列（CMOS MEAS）包含数千个密集的传感器位点，并且通常用于生物技术应用中，以记录高空间（几乎没有……几十µm）和高时间分辨率的神经元活性和高度分辨率（高达20 kHz带翼）。CMOS MEAs能够以几毫秒数的时间精度和数十微米的空间精度刺激活性[1-3]。未开发的CMOS MEA的应用是它们通过记录和分析由电阻粘附裂隙引起的电压噪声来检测粘附细胞的能力[4-6]。这可能归因于该方法，该方法需要考虑传感器位点的规模，粘附单元的大小，连接电容和相应的采样频率。在这里，我们采用两种不同类型的CMOS MEA和相应的记录系统来评估其可靠的无标签检测能力检测粘附细胞培养的能力（癌细胞系HT-29）。细胞粘附电压噪声通过光谱功率密度（S V）分析。