摘要:尽管大豆蛋白质量很高,但由于 Kunitz (KTi) 和 Bowman-Birk 蛋白酶抑制剂 (BBis) 的存在,生大豆和豆粕不能直接添加到动物饲料混合物中,这会降低动物的生产率。热处理可以显著灭活胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂 (BBis),但这种处理耗能大、成本高,并对种子蛋白的质量产生负面影响。作为一种替代方法,我们采用 CRISPR/Cas9 基因编辑来在 BBi 基因中产生突变,从而大幅降低大豆种子中的蛋白酶抑制剂含量。农杆菌介导的转化被用于产生几个稳定的转基因大豆事件。使用 Sanger 测序、蛋白质组学分析、胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂活性测定和 qRT-PCR 将这些独立的 CRISPR/Cas9 事件与野生型植物进行了比较。总的来说,我们的结果表明,影响大豆主要 BBi 基因的一系列等位基因功能丧失突变的产生。两个高表达种子特异性 BBi 基因的突变导致胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂活性大幅降低。
花粉粒的数量在物种内和物种间存在差异。然而,与雄蕊细胞分化方面的研究相比,人们对这一数量性状的分子基础知之甚少。最近,通过拟南芥的全基因组关联研究,分离出了第一个负责花粉数量变异的基因 REDUCED POLLEN NUMBER1 (RDP1),并表现出自然选择的特征。该基因编码酵母 Mrt4 (mRNA 转换 4) 的同源物,它是大核糖体亚基的组装因子。然而,没有进一步的数据将核糖体功能与花粉发育联系起来。在这里,我们使用标准 A. thaliana 登录号 Col-0 表征了 RDP1 基因。由 CRISPR/Cas9 产生的移码突变体 rdp1-3 揭示了 RDP1 在开花中的多效性作用,从而表明该基因是花粉发育以外的多种过程所必需的。我们发现,天然的 Col-0 等位基因导致 Bor-4 等位基因的花粉数量减少,这是通过定量互补测试评估的,该测试比转基因实验更敏感。结合通过序列比对确定的 Col-0 中的历史重组事件,这些结果表明 RDP1 的编码序列是导致自然表型变异的候选区域。为了阐明 RDP1 参与的生物学过程,我们进行了转录组分析。我们发现负责核糖体大亚基组装/生物合成的基因在差异调控基因中富集,这支持了 rdp1-3 突变体中核糖体生物合成受到干扰的假设。在花粉发育基因中,编码碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH) 转录因子的三个关键基因(ABORTED MICROSPORES ( AMS )、bHLH010 和 bHLH089 )以及 AMS 的直接下游基因在 rdp1-3 突变体中下调。总之,我们的结果表明核糖体通过 RDP1 在花粉发育中发挥特殊功能,RDP1 含有受选择的天然变体。
结直肠癌(CRC)在中国癌症中的发病率最高和第三高死亡率(1,2),大约15%的转移性CRC患者患有BRAF基因突变和预后不良(3,4)。Braf Oncogenes通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径(5)来促进肿瘤发生,而V600E突变是最常见的BRAF突变。V600E突变患者的死亡风险是野生型BRAF患者的两倍,因为前者中的大多数人都对化疗和靶向药物疗法具有抗性。尽管一些小样本研究表明,与贝伐单抗相结合的三药化疗(FOLFOXIRI)可能会在某种程度上改善这些患者的预后,但生存益处似乎有限(6,7)。因此,对BRAF V600E突变的新型药物和治疗方案的探索构成了紧急的临床优先事项。
摘要:气孔免疫是植物病原体防御系统的主要门。与发病机理相关的非表达1(NPR1)是水杨酸(SA)受体,这对于气孔防御至关重要。sa诱导了气孔闭合,但是NPR1在后卫细胞中的特定作用及其对系统性获得的耐药性(SAR)的贡献仍然很大未知。在这项研究中,我们比较了野生型拟南芥和NPR1-1基因敲除突变体对病原体攻击的反应,从气孔运动和蛋白质组学变化方面。我们发现NPR1不调节气孔密度,但是在病原体攻击下,NPR1-1突变体未能关闭气孔,导致更多病原体进入叶子。此外,NPR1-1突变体中的ROS水平高于野生型中的ROS水平,并且几种参与碳固化,氧化磷酸化,糖酵解和谷胱甘肽代谢的蛋白质在丰度上有所不同。我们的发现表明,移动SAR信号通过启动ROS爆发改变了气孔免疫反应,而NPR1-1突变体通过翻译调节具有替代性启动效应。
分子进化的长期追求之一是能够直接从生物体的基因型预测其适应性。有了这种预测能力,研究人员将能够更准确地预测生物体将如何进化以及如何设计具有新功能的蛋白质,从而带来医学和生物技术的革命性进步。在这项工作中,我们汇集了已报道的最大一组实验性 TEM-1 β-内酰胺酶折叠自由能,并将这些数据与之前获得的适应性数据和计算自由能预测结合起来,以确定 β-内酰胺酶的适应性有多少可以通过热力学折叠和结合自由能直接预测。我们专注于 β-内酰胺酶,因为它作为模型酶已有悠久历史,并且在抗生素耐药性中发挥着核心作用。基于一组 21 个专门设计用于影响蛋白质折叠的 β-内酰胺酶单突变体和双突变体,我们首先证明,用于计算折叠自由能的建模软件(例如 FoldX 和 PyRosetta)可以有意义地(尽管不是完美地)预测单突变体的实验折叠自由能。有趣的是,虽然这些技术也能产生合理的双突变体自由能,但我们表明它们这样做是出于错误的物理原因。然后,我们继续评估实验和计算折叠自由能对单突变体适应性的解释程度。我们发现,根据线性模型,折叠自由能最多可解释 β-内酰胺酶适应性值方差的 24%,而且,有点令人惊讶的是,用计算预测的活性位点附近残基的结合自由能补充折叠自由能只会使折叠数字增加几个百分点。这强烈表明,β-内酰胺酶的适应性大部分由自由能以外的因素控制。总体而言,我们的研究结果揭示了
图5说明了独立的组织病理学评估的结论。通过Echo2Pheno(ACNAT2,CMAS,DNAJB14,ECHS1,ECHS1,ERGIC2,GSTM1)验证了六项无关紧要的研究。在那些情况下,组织学检查在所有研究中揭示了结构正常的心脏(图5b),确认我们的发现。四个手动得出的大量研究通过Echo2Pheno(CISD1,DMD,FabP2,ZFP280D)进行了验证。四分之一的CISD1突变体显示出中度的LV扩张,而DMD突变体没有LV改变,而是局灶性心肌炎症,支持本研究中的EF和FS改变。FABP2心脏正常,而四个检查的ZFP280D雄性突变体中有两个lvs扩张,炎症性浸润,纤维化和坏死灶中的一个
和缺失分别以+和-表示。i 使用酶StuI对T0纯合突变体进行限制性消化筛选。野生型Solanum etuberosum产生消化的PCR带(蓝色箭头),而突变植物产生对StuI消化有抗性的PCR带。J、k CR-SeSP5G突变体在短日照条件下开花,而野生型在短日照条件下不能开花。比例尺:1厘米;NF,无花。
KO-2806,一种Farnesyl转移酶抑制剂,将KRAS G12C NSCLC肿瘤重新敏感为KRAS G12C突变体特异性抑制剂
摘要 志贺氏菌是一种革兰氏阴性细菌,可侵入人体肠道上皮。由此引起的感染志贺氏菌病是最致命的细菌性腹泻病。有关决定志贺氏菌病理生理的基因(包括染色体和毒力质粒)的大部分信息都是通过经典反向遗传学获得的。然而,流行的诱变技术的技术限制使得单次反应中只能产生少量突变体,从而阻碍了大规模的志贺氏菌靶向诱变和随后的表型评估。我们采用了一种 CRISPR-Cas 依赖性方法,其中切口酶 Cas9 和胞苷脱氨酶融合在单向导 RNA(sgRNA)的引导下引入靶向 C ! T 转换,导致内部终止密码子和翻译过早终止。在使用 mCherry 荧光报告基因的原理验证实验中,我们能够在大肠杆菌和志贺氏菌中生成功能丧失突变体,效率高达 100%。使用改进的波动分析,我们确定在优化条件下,由 Cas9 脱氨酶融合引入的非靶向突变的频率与自发突变在同一范围内,这使我们的方法成为细菌诱变的安全选择。此外,我们对该方法进行了编程,以突变已充分表征的染色体和质粒携带的志贺氏菌基因,并发现突变体的表型与已报道的基因缺失突变体的表型相似,在表型水平上没有明显的极性效应。该方法可用于 96 孔板格式,以提高通量并在几天内生成一系列靶向功能丧失突变体。