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临床前嗜铬细胞瘤和副神经节瘤模型_细胞系、动物模型和人类原代培养模型
尽管数十年的研究证明建立人类嗜铬细胞瘤和副神经节瘤 (PPGL) 细胞系尤为困难，但目前还有其他可靠的临床前 PPGL 模型可用。本综述总结了这些模型，以及我们最近使用患者来源的 PPGL 原代培养物建立的个性化药物筛选平台。当前可用的 PPGL 模型包括小鼠和大鼠 PPGL 细胞系（其中只有一个细胞系（PC12）可通过细胞库公开访问）和 PPGL 动物模型（其中患者来源的异种移植模型很有前景但建立起来很复杂）。我们已经开发出下一代人类 PPGL 原代培养物实施方案，能够根据肿瘤独特的遗传、生化、免疫组织化学和临床特征进行可靠和个性化的药物筛选，以及对肿瘤药物反应性的个体化分析。总体而言，可靠的 PPGL 模型（包括患者来源的原代培养模型）对于推进 PPGL 领域的临床前研究至关重要。© 2024 作者。由 Elsevier Ltd. 出版。这是一篇根据 CC BY 许可开放获取的文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。
细辛醚在乳腺癌细胞系中具有抗增殖潜力
乳腺癌是全球面临的重大健康挑战，需要不断探索新的治疗方法。细辛酮是一种来自菖蒲属的生物活性化合物，具有良好的抗癌特性，但其对乳腺癌细胞的影响尚未得到充分研究。本研究使用体外和计算机模拟方法研究了细辛酮对乳腺癌细胞系的抗癌潜力。使用 DPPH 自由基清除试验评估了细辛酮的抗氧化活性，结果显示其对自由基具有剂量依赖性（25.56%、32.18%、47.73%、54.83% 和 66.74%）。MTT 试验显示细胞活力呈剂量依赖性下降，表明细辛酮对乳腺癌细胞具有细胞毒性。 mRNA 表达分析表明，针对凋亡调节因子，例如 Bax（1、1.3、1.52 倍变化上调）和 Bad（1、1.4 和 1.6 倍变化上调）基因表达，表明细辛醚通过内在途径诱导细胞凋亡。此外，细辛醚抑制 Akt mNRA（1、0.6 和 0.4 倍变化下调）、caspase-3（1、1.4 和 1.7 倍变化上调）和细胞色素 c mRNA（1、1.2 和 1,54 倍变化上调），表明干扰关键的癌症进展途径。分子对接研究预测细辛醚与参与细胞凋亡和细胞存活的关键蛋白质（包括 Bax、Bad、细胞色素 c、caspase 3 和 Akt）之间存在有利的结合相互作用。这些发现共同强调了细辛醚对乳腺癌细胞的多方面抗癌机制。这项研究强调了阿魏酸作为乳腺癌天然治疗剂的潜力，为进一步探索转化研究和临床试验提供了途径。本研究大大提高了我们对阿魏酸抗癌特性的认识，为开发新的有效乳腺癌疗法提供了有希望的方向。
H3.3K27M 突变控制儿童胶质瘤细胞系的细胞生长和治疗耐药性
简单总结：虽然现在已经确定 H3.3K27M 突变与弥漫性中线胶质瘤的肿瘤发生有关，但它在治疗耐药性以及因此导致的致命结果中的作用仍然鲜为人知。在这里，得益于我们在儿童胶质瘤细胞中诱导 H3.3K27M 的模型，我们终于阐明了这一关键问题。因此，我们首次证明 H3.3K27M 可以独立于 TP53 改变而增加细胞的放射抗性能力。此外，由于药物库筛选，我们证明这种突变可以根据细胞环境显著调节这些细胞对不同类别化合物的反应，从而为新的治疗策略铺平了道路。总之，我们的研究结果证明，除了在肿瘤发生中的作用之外，H3.3K27M 突变的存在本身会改变儿童胶质瘤细胞对治疗的反应。
建立 GPR146 敲除人类诱导多能干细胞系 (ITXi001-A-1)
动脉粥样硬化性心血管疾病 (ASCVD) 仍然是全球最大的死亡原因 2 。血脂异常是与 ASCVD 发展有关的一个关键的可改变的因果风险因素。最近，G 蛋白偶联受体家族的成员 G 蛋白偶联受体 146 (GPR146) 被证明是血浆胆固醇的调节剂 3,4 。GPR146 在小鼠体内的肝脏抑制已显示出良好的特性，它对高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有保护作用，这种作用独立于低密度脂蛋白受体 (LDLR) 通路 3 。为了更好地理解所涉及的生物学机制，我们开发了一种先进的基因工程人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 模型，该模型因 GPR146 而无效。 GPR146 -/- 细胞系 (ITXi001-A-1) 源自我们实验室先前从尿液祖细胞 (ITXi001-A) 1 中重新编程的对照 hiPSC 的基因组版本。基因组版本使用 Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统 (Integrated DNA Technologies) 进行，针对两个等位基因上的 GPR146 外显子 2。ITXi001-A-1 是通过挑选单个菌落建立的，其基因型通过 PCR 筛选 (图 1A - 上图和下图) 并通过 Sanger 测序确认 (图 1B)。我们进一步表明，GPR146 基因的遗传版本不会诱导基因组的脱靶版本（筛选 10 个预测位点 - （补充文件 3A）），也不会诱导 ITXi001-A-1 细胞的基因组完整性（分析 24 个拷贝数变异）（补充文件 1）。我们验证了 ITXi001-A-1 细胞不含支原体（补充文件 3B），并且它们与最初采集的尿液细胞来自同一个体（16 个 STR 的亲子鉴定 - 补充文件 2）。总体而言，ITXi001-A-1 细胞呈现：I- 与 ITXi001-A 细胞相比具有相似的形态（图 1C）II- 多能性标志物的阳性表达（通过 OCT3/4 和 TRA-1–60 的免疫荧光染色检测）（图 1D）。 III- 多能性细胞表面标志表达阳性（流式细胞术检测 SSEA-4 和 TRA1-60）（图 1E）。IV- 多能性标志物的表达水平与 ITXi001-A 细胞相同（NANOG、POU5F1 和 SOX2 - 通过 RT-qPCR 测量）（图 1F）。V- 具有优异的分化为中胚层、内胚层和外胚层的能力（通过 SOX17 和 FOXA2（中胚层）；T(TBXT) 和 HAND1（内胚层）以及 PAX6 和 SOX1（外胚层）的 RT-qPCR 评估，与 ITXi001-A 细胞相似）（图 1G）。
研究二甲双胍和昔罗舍平对 PC3 和 THP-1 癌细胞系的合成致死率
摘要 口服抗糖尿病药二甲双胍已被证实在各种癌细胞系中具有抗肿瘤活性，与线粒体复合物 I 的抑制有关。然而，临床前研究一直难以证明这种抗肿瘤活性，其利用的二甲双胍浓度与标准抗糖尿病剂量可达到。研究表明，二甲双胍与抗高血压药物昔洛舍平联合使用，通过抑制单羧酸转运蛋白 (MCT)1/MCT4，可降低二甲双胍的治疗阈值并使癌细胞对杀伤敏感。这些药物之间的强相互作用可引起对转化细胞特有的合成致死性。这项初步研究旨在通过测量 PC3（粘附）和 THP-1（悬浮）癌细胞系中的细胞活力和细胞外乳酸来研究二甲双胍的抗肿瘤作用及其与昔洛舍平的协同关系。总体而言，PC3 细胞系对二甲双胍和昔罗舍平联合治疗或单独使用其中一种药物的治疗反应更好；然而，在两种细胞系中均未观察到合成致死。在两种细胞系中，二甲双胍和昔罗舍平之间的相互作用在细胞活力测定中并不具有统计学意义（p>0.05）。通过测量细胞外乳酸对 MCT1/MCT4 抑制的分析并不具有统计学意义（p>0.05），并且结果尚无定论。此外，在某些治疗组中，细胞系的性质（粘附或悬浮）具有统计学意义（p<0.05），这表明这可能在药物治疗的疗效中发挥作用。需要进一步研究以更好地了解二甲双胍和昔罗舍平合成致死以及昔罗舍平 MCT1/MCT4 抑制的潜在细胞机制。未来的研究应侧重于实现能够在体内表现出抗肿瘤作用的二甲双胍剂量。关键词：二甲双胍、昔罗舍平、THP-1、PC3、单羧酸转运蛋白、MCT1、MCT4、粘附细胞系、悬浮细胞系、前列腺癌、急性髓细胞白血病、抗肿瘤、合成致死。
CRISPR使用霓虹灯电穿孔对永生的细胞系编辑
该方案描述了如何将核糖核蛋白（RNP）复合物组成，这些复合物由纯化的CAS9核酸酶复制，用化学改良的合成单导剂RNA（SGRNA）复制到永生的粘附或悬浮液中。包括一个敲门选项。RNP递送是使用Thermo Fisher Neon™转染系统完成的。包括各种细胞类型的电穿孔设置的参考。化学修饰的SGRNA旨在抵抗可导致细胞死亡的外核酸和先天的细胞内免疫级联反应。Editco化学修改的合成SGRNA具有特殊的纯度，并且始终驱动高编辑频率。
使用 24 孔板脂质体转染技术对含有 RNP 的永生化细胞系进行 CRISPR 编辑
本方案描述了如何将由纯化的 Cas9 核酸酶与化学修饰的合成单向导 RNA (sgRNA) 组成的核糖核蛋白 (RNP) 复合物递送至标准永生化细胞系（粘附或悬浮）。尽管针对 HEK293（人胚胎肾 293 细胞）进行了优化，但本方案可能适用于许多其他细胞系（例如 A549、U2OS、HeLa、CHO、MCF-7）。RNP 递送是使用 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ 转染试剂完成的。化学修饰的 sgRNA 旨在抵抗核酸外切酶的降解并防止可能导致细胞死亡的先天性细胞内免疫级联。本方案可用于转染 EditCo 的多向导基因敲除试剂盒。
使用 RNP 在永生化细胞系中进行阵列式 CRISPR 多向导文库核转染
功能测定通常使用阵列式 CRISPR 筛选进行，以关联每种基因扰动对细胞功能、形态或生理学方面的影响。优化所选测定至关重要，以确保其能够可靠地识别感兴趣的表型。这可以使用测定特异性阳性和阴性对照来完成（参见第 5 页的建议对照表）。此外，优化 CRISPR 编辑和测定之间的时间也很重要，以确保可以测量清晰的表型信号。测定特异性阳性对照可用于此目的。
化学疗法后黑色素瘤细胞系中Pd-L1，Vista和CTLA-4基因表达的上调：一项体外研究
抽象背景：黑色素瘤是一种侵略性的皮肤癌，由于其发病率上升和治疗功效有限，因此引起了大量研究的关注。肿瘤细胞通常会变得更具侵略性的化学后疗法，避免先天和适应性免疫反应，从而导致复发和转移。识别抗化疗的机制对于降低死亡率至关重要。阴性免疫途径，例如T-淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），程序性死亡 - 凸线1（PD-L1）和T细胞激活（VISTA）的V型域Ig抑制因子（VISTA）阻碍对癌症的免疫反应。这项研究旨在发现黑色素瘤癌细胞系中关键免疫检查点，PD-L1和CTLA-4的表达模式的动态变化。方法：在这项研究中，使用常规细胞培养技术培养了A-375黑色素瘤癌细胞系。使用MTT检验确定了IC50（半Ximimal抑制浓度）和化学疗法药物，多西他赛和阿霉素的疗效评估。在使用定量逆转录 - 聚合酶链反应（QRT-PCR）进行了治疗后，对A-375细胞系中Pd-L1，CTLA-4和Vista基因的表达进行分析。单向方差分析（ANOVA）用于统计分析。所有实验均以一式三份进行，显着性设置为p <0.05。统计显着性表示如下：*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。结果：在ADO组和ADC组中都观察到了Vista表达的显着上调。在ADC组中， CTLA-4的表达显着增加，而在ADO组中未观察到显着变化。 与对照组相比，ADO组和ADC组的 PD-L1表达显着更高。 结论：这些引人入胜的发现强调了化学治疗剂对免疫检查点基因表达增强的深远影响，从而阐明了与免疫反应调节有关的重要途径的潜在调节。 关键字：黑色素瘤，化学疗法，免疫检查点，Vista，CTLA-4，PD-L1CTLA-4的表达显着增加，而在ADO组中未观察到显着变化。与对照组相比，ADO组和ADC组的 PD-L1表达显着更高。 结论：这些引人入胜的发现强调了化学治疗剂对免疫检查点基因表达增强的深远影响，从而阐明了与免疫反应调节有关的重要途径的潜在调节。 关键字：黑色素瘤，化学疗法，免疫检查点，Vista，CTLA-4，PD-L1PD-L1表达显着更高。结论：这些引人入胜的发现强调了化学治疗剂对免疫检查点基因表达增强的深远影响，从而阐明了与免疫反应调节有关的重要途径的潜在调节。关键字：黑色素瘤，化学疗法，免疫检查点，Vista，CTLA-4，PD-L1
蜂毒肽增强靶向抗癌单克隆抗体对癌细胞系的细胞毒作用
贝伐单抗和西妥昔单抗等单克隆抗体彻底改变了靶向免疫疗法，并在治疗肺癌和肝细胞癌方面显示出良好的效果。然而，观察到了一系列副作用，这促使人们开发出在保持其疗效的同时尽量减少 mAb 副作用的方法。蜂毒素是 BV 的主要成分，最近有人提出将其作为一种有前途的天然产物，与免疫疗法联合使用以降低所用的有效剂量。在这里，我们研究了蜂毒素与贝伐单抗和西妥昔单抗联合使用对降低这些 mAb 治疗剂量的影响。我们测量了贝伐单抗和西妥昔单抗单独使用或与蜂毒素联合使用对肺癌和肝细胞癌细胞系（分别为 A549 和 HepG2）的影响。我们的结果表明，当任一药物与蜂毒素联合使用时，贝伐单抗和西妥昔单抗在 A549 和 HepG2 癌细胞系中的细胞毒性增强，这是通过 MTT 测定的组合指数计算得出的。这些结果通过组织病理学检查和流式细胞术凋亡分析得到证实。从机制上讲，RT ‑ qPCR 表明这种协同作用与 CASPASE3、Bcl2、VEGFR2 和 EGFR 基因表达的显著变化有关。我们的研究结果表明，将蜂毒素与贝伐单抗和西妥昔单抗联合使用可增强其对癌细胞系的有效性。