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World File Search System脱氨酶
人类胚胎干细胞主要编辑结果的综合分析
Prime editing 是一种多功能且精确的基因组编辑技术，无需供体 DNA 即可将所需的基因修饰直接复制到目标 DNA 位点。该技术在基因功能分析、疾病建模和临床相关细胞（如人类多能干细胞 (hPSC)）中的致病突变校正方面具有巨大前景。在这里，我们通过生成一个可由强力霉素诱导的 Prime editing 平台，全面测试了 hPSC 中的 Prime editing。Prime editing 成功诱导了所有类型的核苷酸替换以及小插入和缺失，与其他人类细胞类型中的观察结果相似。此外，我们比较了 Prime editing 和碱基编辑在纠正来自 α 1- 抗胰蛋白酶 (A1AT) 缺乏症患者的诱导多能干细胞中的疾病相关突变方面的表现。最后，全基因组测序表明，与胞嘧啶碱基编辑器的 21 胞苷脱氨酶结构域不同，22 引物编辑器的逆转录酶结构域不会导致基因组中不依赖 RNA 的脱靶突变。23 我们的结果表明，hPSC 中的引物编辑具有补充 24 先前开发的 CRISPR 基因组编辑工具的巨大潜力。25
senataxin和rNase H2起作用，以抑制类开关重组期间的基因组不稳定性
抽象类开关重组产生的不同的抗体同种型对鲁棒的适应性免疫系统至关重要，并且缺陷与自身免疫性疾病和淋巴瘤相关。在类开关重组期间需要转录才能募集胞苷脱氨酶AID（这是形成DNA双链断裂的重要步骤），并强烈诱导了免疫球蛋白重链链基因座内的R环形成。但是，R回路对上课开关重组期间双链断裂形成和修复的影响尚不清楚。在这里，我们报告说，缺乏参与R环去除的酶的细胞 - 纳经素和RNase H2 - 证明在免疫球蛋白重链重链链路上增加了R环的形成和基因组不稳定性，而不会影响其转录活性，辅助招募或类转换的重组效率。senataxin和RNase H2缺陷型细胞在开关连接处也表现出增加的插入突变，这是替代末端连接的标志。重要的是，在缺乏鼻蛋白酶或RNase H2b的细胞中未观察到这些表型。我们提出，Senataxin用RNase H2冗余起作用，以介导及时的R环去除，从而促进有效的修复，同时抑制辅助依赖性基因组不稳定性和插入诱变。
免疫・微生物学教室セミナー Evolutionary trajectory of ...
Ryo Morimoto，医学博士，博士莫里莫托（Morimoto）发展生物学系（BOEHM LAB），MAX PLANCK免疫生物学和表观遗传学研究所日期和时间：2024年1月24日，星期三，10：30-11：30地点：药学毕业生，医学院毕业生，从10：30：30：30：药房，来自四楼的药房，药学研究生院，语言：日语联系人：Hori Shohei（Ext。） 24820）摘要：针对病原体的人类自卫系统由两个主要的武器组成：先天和适应性免疫组织化学。 与先天抗原受体（AGR）识别模式识别的组合以及淋巴细胞表达的自适应AGR的预期模式对于建立我们精心策划的自卫以及保持体内平衡是必不可少的。 值得注意的是，这种复杂的系统仅在脊椎动物物种中建立，而大多数无脊椎动物物种仅取决于先天的免疫反应。 为了了解我们“现代”系统的进化紧急和轨迹，我想引入在无知的脊椎动物（hagfishes and Lampreys）中发现的替代自适应免疫学，这是一个与颚式脊椎动物（从鲨鱼到人类）5亿年前分离的小姐妹群体。 虽然它们的替代系统具有适应性免疫学的体液和细胞臂，但AGR的分子实体基于富含亮氨酸的重复模块。 与我们的V（d）J重组通过RAG1/2活性相反，AGRS的组装是通过基于胞苷脱氨酶（CDA）功能的一系列基因转换步骤来实现的。Ryo Morimoto，医学博士，博士莫里莫托（Morimoto）发展生物学系（BOEHM LAB），MAX PLANCK免疫生物学和表观遗传学研究所日期和时间：2024年1月24日，星期三，10：30-11：30地点：药学毕业生，医学院毕业生，从10：30：30：30：药房，来自四楼的药房，药学研究生院，语言：日语联系人：Hori Shohei（Ext。24820）摘要：针对病原体的人类自卫系统由两个主要的武器组成：先天和适应性免疫组织化学。与先天抗原受体（AGR）识别模式识别的组合以及淋巴细胞表达的自适应AGR的预期模式对于建立我们精心策划的自卫以及保持体内平衡是必不可少的。值得注意的是，这种复杂的系统仅在脊椎动物物种中建立，而大多数无脊椎动物物种仅取决于先天的免疫反应。为了了解我们“现代”系统的进化紧急和轨迹，我想引入在无知的脊椎动物（hagfishes and Lampreys）中发现的替代自适应免疫学，这是一个与颚式脊椎动物（从鲨鱼到人类）5亿年前分离的小姐妹群体。虽然它们的替代系统具有适应性免疫学的体液和细胞臂，但AGR的分子实体基于富含亮氨酸的重复模块。与我们的V（d）J重组通过RAG1/2活性相反，AGRS的组装是通过基于胞苷脱氨酶（CDA）功能的一系列基因转换步骤来实现的。
RNA编辑：拓展RNA治疗的潜力
RNA 疗法对医学产生了巨大影响，最近迅速开发和部署用于抗击 COVID-19 大流行的 mRNA 疫苗就是一个例证。此外，通过选择性 mRNA 敲低或调节前 mRNA 剪接，已经开发出针对 RNA 靶向药物，用于治疗具有重大未满足医疗需求的疾病。最近，RNA 编辑，特别是反义 RNA 引导的腺苷脱氨酶作用于 RNA (ADAR) 的可编程 A-to-I 编辑，已成为操纵 RNA 的有力工具，可以纠正致病突变并调节基因表达和蛋白质功能。除了纠正致病突变外，该技术特别适合需要短暂药效学作用的治疗应用，例如治疗急性疼痛、肥胖、病毒感染和炎症，在这些情况下，不希望对基因组造成永久性改变。此外，蛋白质功能的瞬时调节，例如改变酶的活性位点或蛋白质-蛋白质相互作用的界面，为从再生医学到肿瘤学等各种治疗途径打开了大门。这些新兴的基于 RNA 编辑的工具集有望广泛影响生物技术和治疗应用。在这里，我们回顾了治疗性 RNA 编辑的新兴领域，重点介绍了最近的实验室进展，并讨论了临床开发道路上的关键挑战。
RNA编辑：拓展RNA治疗的潜力
RNA 疗法对医学产生了巨大影响，最近迅速开发和部署用于抗击 COVID-19 大流行的 mRNA 疫苗就是一个例证。此外，通过选择性 mRNA 敲低或调节前 mRNA 剪接，已经开发出针对 RNA 靶向药物，用于治疗具有重大未满足医疗需求的疾病。最近，RNA 编辑，特别是反义 RNA 引导的腺苷脱氨酶作用于 RNA (ADAR) 的可编程 A-to-I 编辑，已成为操纵 RNA 的有力工具，可以纠正致病突变并调节基因表达和蛋白质功能。除了纠正致病突变外，该技术特别适合需要短暂药效学作用的治疗应用，例如治疗急性疼痛、肥胖、病毒感染和炎症，在这些情况下，不希望对基因组造成永久性改变。此外，蛋白质功能的瞬时调节，例如改变酶的活性位点或蛋白质-蛋白质相互作用的界面，为从再生医学到肿瘤学等各种治疗途径打开了大门。这些新兴的基于 RNA 编辑的工具集有望广泛影响生物技术和治疗应用。在这里，我们回顾了治疗性 RNA 编辑的新兴领域，重点介绍了最近的实验室进展，并讨论了临床开发道路上的关键挑战。
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
两种紧凑型 Cas9 直系同源物胞嘧啶碱基编辑器扩大了 DNA 靶向范围以及体内外应用
基于 CRISPR/Cas9 的碱基编辑工具可实现精确的基因组安装，并为基因治疗带来巨大希望，而 Cas9 核酸酶的大尺寸、其对特定原间隔区相邻基序 (PAM) 序列的可靠性以及靶位偏好限制了碱基编辑工具的广泛应用。在这里，我们通过将胞嘧啶脱氨酶与来自 Streptococcus_gordonii_str._Challis_substr._CH1 (ancSgo-BE4) 和 Streptococcus_thermophilus_LMG_18311 (ancSth1a-BE4) 的两个紧凑的密码子优化的 Cas9 直系同源物融合来生成两个胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，它们比化脓性链球菌 (SpCas9) 小得多，分别识别 NNAAAG 和 NHGYRAA PAM 序列。这两种 CBE 在胞嘧啶碱基编辑中都表现出高活性、高保真度、不同的编辑窗口和低副产物，并且在哺乳动物细胞中 DNA 和 RNA 脱靶活性极小。此外，在我们测试的靶位点上，这两种编辑器都表现出与两种基于 SpCas9 工程变体（SpCas9-NG 和 SpRY）的 CBE 相当或更高的编辑效率，它们与 ancSgo-BE4 或 ancSth1a-BE4 的 PAM 序列完美匹配。此外，我们通过 ancSgo-BE4 和 ancSth1a-BE4 成功生成了两种在 Ar 基因处带有临床相关突变的小鼠模型，它们在创始小鼠中表现出雄激素不敏感综合征和/或发育致死性。因此，这两种新型 CBE 拓宽了碱基编辑工具包，分别扩大了靶向范围和窗口，以实现有效的基因修饰和应用。
APOBEC3B 报告骨髓瘤细胞系识别导致 APOBEC3B 表达的 DNA 损伤反应途径
载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽样 (APOBEC) DNA 胞嘧啶脱氨酶 3B (A3B) 是一种 DNA 编辑酶，可诱导多发性骨髓瘤和其他各种癌症的基因组 DNA 突变。APOBEC 家族蛋白高度同源，因此研究癌细胞中 A3B 的生物学尤其困难。为了轻松全面地研究 A3B 在骨髓瘤细胞中的功能，我们使用 CRISPR/Cas9 生成了 A3B 报告细胞，其中包含 3 × FLAG 标签和整合在 A3B 基因末端的 IRES-EGFP 序列。这些报告细胞稳定表达 3xFLAG 标记的 A3B 和报告基因 EGFP，并且这种表达会受到已知刺激物（例如 PMA）的增强。相反，shRNA 敲低 A3B 会降低 EGFP 荧光和 3xFLAG 标记的 A3B 蛋白水平。我们利用这些细胞系筛选了一系列抗癌疗法，并发现大多数常规疗法（如抗代谢药物或放射疗法）会加剧内源性 A3B 表达，但最近的分子靶向疗法（包括硼替佐米、来那度胺和埃罗妥珠单抗）不会加剧内源性 A3B 表达。此外，在用抗代谢药物治疗时，ATM、ATR 和 DNA-PK 的化学抑制会抑制 EGFP 表达。这些结果表明 DNA 损伤通过 ATM、ATR 和 DNA-PK 信号传导触发 A3B 表达。
内切酶V的缺失可抑制化学诱发的肝细胞癌
内切核酸酶 V (EndoV) 是一种保守的肌苷特异性核糖核酸酶，其生物学功能未知。在这里，我们介绍了第一个缺乏 EndoV 的小鼠模型，该模型可以生存而没有明显异常。我们表明，内源性鼠 EndoV 可在体外裂解含肌苷的 RNA，尽管如此，一系列实验未能将其体内功能与此类转录本的处理联系起来。由于肝细胞癌 (HCC) 中的肌苷水平和腺苷到肌苷的编辑通常失调，我们在小鼠中化学诱导了 HCC。所有小鼠都患上了肝癌，然而，EndoV − / − 肿瘤明显比野生型肿瘤少且小。与人类 HCC 相反，在我们的模型中，腺苷脱氨酶 mRNA 表达和位点特异性编辑没有改变。 EndoV 的缺失不会影响肝肿瘤中的编辑水平，但是一些癌症相关基因的 mRNA 表达会降低。肌苷也存在于某些 tRNA 中，并且 tRNA 在应激过程中会被切割以产生信号实体。在 EndoV − / − 肝脏中，tRNA 碎片化失调，并且显然不依赖于肌苷。我们推测 EndoV 的肌苷核糖核酸酶活性在体内被禁用，但 RNA 结合可以促进转录本的稳定或蛋白质的募集以微调基因表达。EndoV − / − 肿瘤抑制
原发性免疫缺陷的基因疗法
基因治疗是使用自体造血干细胞移植的一级免疫降低（PID）的创新治疗方法，可通过添加或编辑的添加或编辑版本的缺失或出现导致PID的基因的添加或编辑版本来提供干细胞。对1990 - 2000年的PID基因疗法的初步研究，使用了整合鼠γ-逆转录病毒载体。这些研究在许多情况下显示出临床效率，尤其是在再灌注细胞之前的骨髓细胞减少条件条件下，这些载体引起了几名患者的遗传毒性和白细胞增生性疾病的发育。最近的研究使用了慢病毒载体，其中长时间的增强子元素在逆转录过程中重复自我激活（“ sin”载体）。这些犯罪载体具有出色的安全性，并且尚未据报道引起任何临床上显着的遗传毒性。基因疗法已成功治疗了几种PID，包括腺苷脱氨酶严重的合并免疫耐药性（SCID），X连锁SCID，Artemis SCID，Wiskott-Aldrich综合征，X连接的慢性肉芽肿性疾病和白细胞粘附性降低效率。总的来说，在近几十年来，PID的基因治疗在效率和安全性方面已经取得了比同种异体HSCT相等或更好。方法的进一步改善应导致基因治疗的更一致和可靠的效率，以获得越来越多的PID列表。