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原生质体转染进展促进 CRISPR 高效应用
摘要 植物原生质体是利用基因编辑对所需性状进行遗传操作的可靠实验系统。尽管如此，突变原生质体的选择和再生仍具有挑战性，而随后恢复成功编辑的植物是先进植物育种技术的一个重要瓶颈。为了缓解与原生质体转基因表达和原生质体再生相关的障碍，开发了一种新方法。结果表明，线性化 DNA 可以有效转染马铃薯原生质体，而来自各种植物的 UBIQUITIN10 启动子可以有效地指导转基因表达。此外，还对转染原生质体的卡那霉素抑制浓度进行了标准化，新霉素磷酸转移酶 2 ( NPT2 ) 基因可用作富集转染原生质体的有力选择标记。此外，BABYBOOM ( BBM ) 转录因子的瞬时表达促进了原生质体衍生愈伤组织的再生。总之，这些方法显著增加了对表现出高转基因表达的原生质体的筛选，从而显著提高了原生质体衍生愈伤组织中基因编辑事件的发生率，达到 95%。本研究开发的方法促进了四倍体马铃薯植物的基因编辑，并为多倍体生物中的复杂基因操作开辟了道路。
多价阳离子脂质体-DNA复合物介导的体外CRISPR/Cas9转染和基因编辑
摘要：成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关核酸酶 9 (Cas9) 基因编辑为癌症、心血管、神经和免疫疾病等遗传病因的疾病治疗提供了令人兴奋的新治疗可能性。然而，由于缺乏安全、多功能和有效的非病毒递送系统，其临床转化受到阻碍。本文我们报告了两种阳离子脂质体-DNA 系统（即脂质复合物）的制备和应用，用于 CRISPR/Cas9 基因递送。为此，使用了两种阳离子脂质（DOTAP，单价，和 MVL5，多价，+5 e 标称电荷），以及三种辅助脂质（DOPC、DOPE 和单油精 (GMO)）。我们证明，编码 Cas9 和单向导 RNA (sgRNA) 的质粒（由于其较大 (>9 kb) 通常难以转染）可以通过基于 MVL5 的脂质体成功转染到 HEK 293T 细胞中。相比之下，基于 DOTAP 的脂质体转染率非常低。基于 MVL5 的脂质体表现出逃离溶酶体的能力，这可能解释了其卓越的转染效率。在基因编辑方面，基于 MVL5 的脂质体实现了有希望的 GFP 敲除水平，在电荷比 (+/-) 为 10 时达到超过 35% 的敲除率。尽管敲除效率与 Lipofectamine 3000® 商业试剂相当，但基于 MVL5 的制剂中的非特异性基因敲除更为明显，这可能是因为这些制剂具有相当大的细胞毒性。总之，这些结果表明，多价脂质基脂质体复合物是有前途的 CRISPR/Cas9 质粒递送载体，通过进一步优化和功能化，其可能成为合适的体内递送系统。
Invitrogen转染产品
CRISPR-CAS9是一种用于基因组编辑和工程的既定方法，包括在对特定基因组裂解事件不完善的修复后，基因表达敲除诱导。Invitrogen™Lentipool V2人CRISPR文库已开发用于功能丧失研究，以确定基因在调节细胞过程中的作用以及对化合物，药物或任何可能影响这些过程的任何扰动者的细胞反应。Lentipool V2人类CRISPR库中包含的CRISPR-CAS9指南RNA（GRNA）是基于专有GRNA设计算法设计的，该算法选择指南以最大程度地敲除效率而不牺牲特异性。每个库包含每个基因的四个序列验证的不同的GRNA矢量构建体，包装为慢病毒颗粒。Lentipool V2人CRISPR库由定制或预定义集合的grnas组成，以特定基因家族为目标，以慢病毒合并格式进行功能基因组学筛选，请参见第29页。
CRISPR介导的Brugia Malayi的转染
由于这些生物的困难生物学，反向遗传学在人类丝状寄生虫中的应用滞后。最近，我们开发了一种共同培养系统，该系统允许转染Brugia Malayi的感染性幼体阶段并有效地发展为Fecund成年人。这是开发基于Piggybac Transposon的工具包的，该工具包可用于生产具有稳定整合到寄生虫基因组中的转基因序列的寄生虫。然而，PiggyBac系统通常已被基于群的常规间隔短篇小学重复序列（CRISPR）技术取代，这允许精确编辑基因组。在这里，我们报告了适应b。马来语用于CRISPR介导的敲入插入寄生虫基因组。在b的基因间区域中鉴定出合适的CRISPR插入位点。马来语基因组。修改了双重记者Piggybac载体，用插入位点的序列替换了Piggybac倒的末端重复区域。b。用合成引导RNA，修饰的质粒和cas9核酸酶转染马来语或其。将转染的寄生虫植入沙鼠中，并允许发展为成年人。后代微丝菌进行了筛选，并筛选了质粒中编码的分泌的荧光素酶报告器的表达。发现大约3％的微丝虫分泌荧光素酶；所有这些都包含插入寄生虫基因组中预期位置的转基因序列。这些数据表明CRISPR可用于修改B的基因组。使用适配器介导的PCR测定法，检查了转基因微丝菌是否存在关闭目标插入；没有发现脱靶插入。马来语，开辟了精确编辑这种重要人类丝状寄生虫的基因组的道路。
2020; 10(12): 5532-5549. doi: 10.7150/thno.43465 评论 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑的新兴物理转染方法综述
基因编辑是生物医学领域的一种多功能技术，可促进基础研究和临床治疗。成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 作为基因组编辑机制的发展加速了基因编辑的应用。然而，由于包装尺寸有限以及对某些细胞类型的效率低下，使用传统转染方法（如病毒转导和化学载体）时，CRISPR 成分的递送通常会受到影响。在这篇综述中，我们讨论了可以克服这些限制的 CRISPR 基因编辑的物理转染方法。我们概述了不同类型的物理转染方法，重点介绍了递送 CRISPR 成分的新技术，并强调了微纳米技术在提高转染性能方面的作用。我们介绍了对当前技术局限性的看法，并对物理转染方法的未来发展提供了见解。
CRISPR 工作流程中的内毒素及其对转染效率的影响
图 3. 内毒素水平比较。根据制造商说明 (Lonza)，使用 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 测试测量使用 QIAGEN 的 EndoFree Plasmid Kit 和 QIAGEN Plasmid Plus Kit 以及 Zymo 的 ZymoPureII Endo-Zero Plasmid Kit 制备的质粒 DNA 样本中的内毒素水平。对于每个试剂盒，对 2 个样本进行 1:100 稀释，重复三次测试。测试的标准曲线范围在 0.005 EU/ml 和 50 EU/ml 之间。EndoFree Plasmid Plus 试剂盒产生的质粒 DNA 不含任何可检测的内毒素，而 Plasmid Plus 试剂盒提供的质粒 DNA 中内毒素含量显著降低。相比之下，ZymoPureII 产生的质粒 DNA 含有大量内毒素。通过琼脂糖凝胶电泳评估的两个试剂盒的质粒 DNA 的产量和质量相当（未显示数据）。
使用 DNA 和蛋白质格式优化转染方法，以实现 Beta-TC-6 细胞中 CRISPR Cas9 介导的基因敲除。
参考文献 • (1) Nessa A、Rahman SA、Hussain K。高胰岛素性低血糖症 - 分子机制。内分泌学前沿。2016；7：29。doi:10.3389/fendo.2016.00029。 (2) Ran FA、Hsu PD、Wright J、Agarwala V、Scott DA、Zhang F。使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组工程。自然协议。2013；8(11):2281-2308。doi:10.1038/nprot.2013.143。 (3) Guo D、Liu H、Ruzi A 等人。使用 CRISPR/Cas9 产生的 ABCC8 缺陷型人类胚胎干细胞模拟先天性高胰岛素症。科学报告。 2017；7：3156。doi:10.1038/s41598-017-03349-w。（4）Nessa A、Rahman SA、Hussain K。先天性高胰岛素血症的分子机制和潜在治疗靶点。孤儿药专家意见。2015；3：8。doi.org/10.1517/21678707.2015.1064819。（5）AP Chandrasekaran、M. Song、KS Kim、S. Ramakrishna。将 CRISPR/Cas9 递送到细胞中的不同方法。Prog Mol Biol Transl Sci，159（2018），第 157-176 页。
用于将核酸转移到 ATCC 细胞中的转染试剂
阳离子脂质有助于将核酸递送到真核细胞中。它们的基本结构由带正电的头部基团和一条或两条烃链组成。带电的头部基团介导脂质与核酸带负电的磷酸骨架之间的相互作用。据推测，这些相互作用导致核酸-脂质体复合物的形成，该复合物随后可能与靶细胞的质膜接触并通过内吞作用被吸入。或者，核酸-脂质体复合物可能与质膜融合并混合，将核酸沉积到细胞质中。
使用核转染技术利用 RNP 对人类 iPS 细胞进行 CRISPR 编辑
使用 RNA 和 RNP • 建议戴上手套并使用无核酸酶的试管和试剂，以避免 RNase 污染。 • 始终保持无菌技术，并使用无菌过滤移液器吸头。 • 所有 Synthego 和 Nucleofector™ 试剂均应根据制造商的建议储存。 • 合成的 sgRNA 应溶解在 TE 缓冲液中，并使用无核酸酶的水稀释至工作浓度。请参阅 Synthego 快速入门指南，了解溶解和储存合成 sgRNA 的最佳实践。 • RNP 可直接在 Nucleofector™ 溶液中形成。 • RNP 复合物在室温下可稳定保存长达 1 小时（可在 4°C 下保存长达一周，或在 -20°C 下保存长达 1 个月）。请注意，在 4°C 下储存的 RNP 长时间后可能会受到微生物生长的污染。
Mirus，转染试剂领域的领先品牌——买一送一……
细胞系特定产品 产品编号 数量 TransIT-293 MIR 2704 0.4 ml 转染试剂 MIR 2700 1 ml TransIT-3T3 MIR 2184 0.4 ml 转染试剂盒* MIR 2180 1 ml TransIT-CHO MIR 2174 0.4 ml 转染试剂盒* MIR 2170 1 ml Trans-COS MIR 2194 0.4 ml 转染试剂盒* TransIT-HeLaMONSTER MIR 2904 0.4 ml 转染试剂盒* MIR 2900 1 ml TransIT-Jurkat MIR 2124 0.4 ml 转染试剂 MIR 2120 1 ml TransIT-Keratinocyte MIR 2804 0.4 ml 转染试剂 MIR 2800 1 ml TransIT-Neural MIR 2144 0.4 ml 转染试剂 MIR 2140 1 ml TransIT-Prostate MIR 2134 0.4 ml 转染试剂盒* MIR 2130 1 ml TransIT-Pro MIR 5700 1 ml