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World File Search SystemAsCas12a
核小体和染色质对 CRISPR-Cas12a DNA 靶向的抑制
基因组工程核酸酶必须接触染色质化的 DNA。在这里，我们研究了 AsCas12a 如何切割人类核小体和相浓缩核小体阵列内的 DNA。使用定量动力学方法，我们表明动态核小体解开调节靶标对 Cas12a 的可及性，并决定核小体抑制结合的两个步骤（PAM 识别和 R 环形成）的程度。通过降低 DNA 可弯曲性、添加组蛋白修饰或引入靶标近端 dCas9 来放松核小体内的 DNA 包裹，可将 DNA 切割率提高 10 倍以上。出乎意料的是，Cas12a 很容易切割染色质状、相分离的核小体阵列内的核小体间接头 DNA。由于相邻的核小体和染色质压缩，DNA 靶向仅减少了约 5 倍。这项研究解释了核小体中的靶向切割发生频率低于细胞中核小体耗尽的基因组区域内的脱靶切割的观察结果。我们得出结论，核小体解开调节 CRISPR-Cas 核酸酶的可及性，并提出增加核小体呼吸动力学将改善真核细胞中的 DNA 靶向性。
通过Cas9增强位点特异性DNA集成...
CRISPR / CAS系统广泛用于基因组编辑。然而，强大的和有针对性的DNA段插入仍然是一个挑战。在这里，我们提出了一个融合核酸酶（CAS9-N57），以通过融合的DNA结合结构域增强位点DNA的整合，以使DNA片段将DNA段带到Cas9 / Sgrna络合物。插入是单向和特定的，并且长度长达12 kb的DNA片段已成功整合。作为对系统的测试，CAS9-N57在人类T细胞中插入CD19特异性嵌合抗基因受体（CD19卡）盒（CD19-CAR）盒中的AAVS1基因座，并通过同时发生的肌肉凝聚和肌肉凝聚在小鼠中，并诱导肌内胆管癌的位置，并促进了inscogen2的inscogen gecogenion inscogenion inscogenion inscogenion ogenition，破坏TRP53和PTEN。更重要的是，基于ASCPF1（ASCAS12A）和CJCAS9的Nuclease-N57融合蛋白表现出相似的活性。这些发现表明，CRISPR-核酸酶-N57蛋白融合是靶向DNA插入的强大工具，并且对基因治疗应用非常有用。
海报 2780
• 自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统的强大效应器，可以直接识别和杀死肿瘤细胞，因此使其成为癌症细胞疗法的有吸引力的选择。 • 由于 NK 细胞存活所需的关键细胞因子（例如白细胞介素 15 (IL-15)）水平低，以及肿瘤内在免疫抑制机制（例如肿瘤微环境中高水平的转化生长因子 β (TGFβ)）缺乏持久性，导致 NK 细胞效力降低。1 此外，当 NK 细胞活化后 CD16 被切割时，NK 细胞发挥抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的能力会受损。2 Editas 专有的基于 AsCas12a 的基因编辑方法用于修改 iNK 细胞，以克服这些生物学限制并增强 NK 细胞功能。 • 我们假设，细胞因子诱导的 SH2 蛋白 (CISH) 基因（IL-2/IL-15 信号的负调节剂）和 TGFβ 受体 2 (TGFβR2) 基因的 DKO 会改善 NK 细胞效应功能，并使其对 TGFβ 介导的抑制产生抵抗力。此外，我们假设，膜结合 IL-15 (mbIL-15) 和 CD16 进入 NK 细胞的 DKI 会延长 NK 持久性，并在与 ADCC 诱导的肿瘤靶向抗体（如曲妥珠单抗）结合时增加细胞毒性。
Cas9 的效率、特异性和温度敏感性...
使用 CRISPR-Cas 核糖核蛋白 (RNPs) 转染递送基因组编辑试剂比基于质粒 DNA 的递送方法具有多种优势，包括减少脱靶编辑效应、减轻非天然 DNA 片段的随机整合、不依赖载体构建以及监管限制较少。与在动物系统中的使用相比，RNP 介导的基因组编辑在植物中仍处于早期发展阶段。在本研究中，我们建立了一个高效、简化的基于原生质体的 CRISPR-Cas RNP 递送基因组编辑平台，然后评估了六种 Cas9 和 Cas12a 蛋白的效率、特异性和温度敏感性。我们的结果表明，Cas9 和 Cas12a RNP 递送在不同温度条件下（22°C、26°C 和 37°C）均导致基因组编辑频率（8.7 – 41.2%），并且没有明显的温度敏感性。 LbCas12a 通常表现出最高的活性，而 AsCas12a 表现出更高的序列特异性。CRISPR-Cas RNPs 在 22° 和 26°C（植物转化和组织培养的首选温度）下的高活性导致原生质体再生愈伤组织和在下一代恢复可遗传突变体的植物中具有高诱变效率（34.0 – 85.2%）。这种 RNP 递送方法进一步扩展到菥蓂 ( Thlaspi arvense )、大豆 ( Glycine max ) 和狗尾草，诱变频率高达 70.2%。总之，这项研究为选择 RNP 试剂以实现植物中有效的无转基因基因组编辑提供了启示。
动量：
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