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TET调节的表达和光学清除，用于遗传编码的嵌合DCAS9/荧光蛋白探针的体内可视化
摘要：Cas9（DCAS9）核酸内切酶的催化无效突变体具有多种生物医学应用，最有用的是转录的激活/抑制。dcas9家族成员也正在成为潜在的实验工具，用于在独立活细胞和完整组织的水平上进行基因映射。我们对CAS9介导的核室可视化的一组工具进行了初步测试。我们研究了doxycycline（DOX） - 可诱导（TET-ON）的细胞内分布，这些构建体的构造中编码DCAS9直系同源物（ST）（ST）和脑膜炎N.脑膜炎（NM）与EGFP和MCHERRY FOLORESCENT蛋白（FP）融合的人类A549细胞。我们还研究了这些嵌合荧光构建体的时间依赖性表达（DCAS9-FP）在活细胞中诱导中的诱导中，并将其与实验性DCAS9-FP表达的时间过程进行了比较灌注。在诱导后24小时内，肿瘤异种移植物发生了麦克利 - 奇氏菌表达的体内诱导，并通过使用皮肤的光学清除（OC）来可视化。OC通过局部应用Gadobutrol启用了肿瘤异种移植物中FP表达的高对比度成像，因为红色和绿色通道的FI增加了1.1-1.2倍。
通过 CRISPR 介导的同源性定向修复和双 AAV6 转导系统将嵌合抗原受体靶向递送到 T 细胞中
摘要：CAR-T 细胞疗法涉及通过在 T 细胞表面添加嵌合抗原受体 (CAR) 对 T 细胞进行基因改造，使其识别和攻击肿瘤细胞。在本研究中，我们使用 AAV 血清型 6 (AAV6) 的双重转导将抗 CD19 CAR 整合到人类 T 细胞的已知基因组位置。第一个病毒载体表达 Cas9 内切酶和针对 T 细胞受体 alpha 恒定基因座的向导 RNA (gRNA)，而第二个载体携带用于同源介导的 CAR 插入的 DNA 模板。我们评估了三种 gRNA 候选物并确定了它们在产生插入/缺失方面的效率。AAV6 成功地在体外传递了 CRISPR/Cas9 机制，双重转导的分子分析表明 CAR 转基因整合到了所需位置。与通常用于生成 CAR-T 细胞的随机整合方法相比，靶向整合到已知基因组位点可以降低插入诱变的风险，并提供更稳定的 CAR 表达水平。至关重要的是，这种方法还可以敲除内源性 T 细胞受体，从而允许从同种异体供体中提取靶细胞。这带来了令人兴奋的“现成”通用免疫疗法的可能性，这将大大简化 CAR-T 细胞的生产和给药。
原发性中枢神经系统淋巴瘤患者接受 CD19 靶向嵌合抗原受体 T 细胞治疗后的疗效
中枢神经系统原发性弥漫大 B 细胞淋巴瘤 (PCNSL) 是一种罕见但侵袭性强的淋巴瘤，通常局限于脑、脊髓、软脑膜、脑脊液和/或玻璃体视网膜空间，不影响全身。1,2 尽管随着治疗方法的不断发展，这些患者的预后有所改善，1 但一线治疗后未达到完全缓解 (CR)（即原发性难治性）的患者或在自体干细胞移植 (ASCT) 后复发的患者生存率较低。3 目前尚无关于这些患者最佳挽救治疗的共识，3 并且已采用不同的治疗策略并取得一定成功。3,4 针对 CD19 的嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 疗法被批准用于治疗全身复发或难治 (R/R) 弥漫大 B 细胞淋巴瘤。 5-7 然而，这些关键试验并未纳入 PCNSL 患者，并且 PCNSL 患者被明确排除在 axicabtagene ciloleucel (axi-cel)、tisagenlecleucel (tisa-cel) 和 lisocabtagene maraleucel (liso-cel) 标签之外。8 自 CAR-T 在美国和欧洲获批以来，已有 4 项小型研究（患者数=5-27）报告了 CAR-T 在 PCNSL 中的初步活性和毒性，这些研究的随访时间相对较短。9-12 我们在此使用来自国际血液和骨髓移植研究中心登记处的数据，对 2019 年 1 月至 2022 年 3 月期间接受商业 CAR-T 细胞疗法的 R/R PCNSL 患者进行了分析。研究人群包括连续、同意的患者（≥18 岁），诊断为 R/R PCNSL，并在指数期间接受了市售 CAR T 细胞疗法（即 axi-cel 或 tisa-cel）。没有患者因年龄、合并症、产品类型或数据完整性而被排除。来自禁运中心的患者被排除在外。主要终点是总生存期 (OS)，定义为从 CAR T 输注到因任何原因死亡的时间。次要终点包括第 100 天的总有效率 (ORR)、无进展生存期 (PFS)（定义为从 CAR-T 到复发/进展性疾病 (PD) 或因任何原因死亡的时间，以先发生者为准）、复发或进展的累积发生率、非复发死亡率 (NRM)、死亡原因、CAR-T 输注后第 30 天任何级别严重细胞因子释放综合征 (CRS) 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 的累积发生率（ASTCT 标准 13 定义），以及中性粒细胞和血小板恢复情况。累积发生率函数用于估计复发/进展、NRM、CRS 和 ICANS，Kaplan-Meier 估计量用于
Enhanced Cytotoxicity against Cholangiocarcinoma by Fifth-Generation Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Integrin αvβ6 and Secreting Anti-PD-L1 scFv
胆管癌（CCA）是一种致命的胆管癌，具有高耐药性和复发率，只有五分之一的患者有资格接受手术治疗。该疾病抵抗了标准的化疗，并且经常复发。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法对血液学恶性肿瘤有望，但由于PD-L1表达等抗性机制，肿瘤用于逃避免疫系统，因此面临实体瘤的挑战。为了应对这一挑战，我们开发了针对整联蛋白αVβ6的第五代CAR T细胞，该细胞还分泌抗PD-L1单链可变片段（SCFV），以靶向肿瘤细胞和PD-1/PD-L1途径。我们在CCA细胞系和工程T细胞中检查了整联蛋白αVβ6和PD-L1的表达，以表达针对整联蛋白αVβ6（A20 CAR4 T细胞）的第四代CAR T细胞，或用抗PD-L1 SCFV分泌（A20 CAR5 T细胞）（A20 CAR5 T细胞）（A20 CAR4 T细胞）或第五代CAR T细胞（A20 CAR5 T细胞）。在体外，与A20 CAR4 T细胞相比，A20 CAR5 T细胞表现出更少的疲惫和长期功能。 在CCA的3D球体模型中，A20 CAR5 T细胞表现出增强的抗肿瘤活性，并更好地浸润到球体核心中。 这些发现表明A20 CAR5 T细胞在体内研究和临床试验中具有巨大的潜力，并需要进一步。在体外，与A20 CAR4 T细胞相比，A20 CAR5 T细胞表现出更少的疲惫和长期功能。在CCA的3D球体模型中，A20 CAR5 T细胞表现出增强的抗肿瘤活性，并更好地浸润到球体核心中。 这些发现表明A20 CAR5 T细胞在体内研究和临床试验中具有巨大的潜力，并需要进一步。在CCA的3D球体模型中，A20 CAR5 T细胞表现出增强的抗肿瘤活性，并更好地浸润到球体核心中。这些发现表明A20 CAR5 T细胞在体内研究和临床试验中具有巨大的潜力，并需要进一步。
进展到嵌合抗原受体T细胞疗法后大B细胞淋巴瘤患者的治疗结果
摘要超过60％的复发/难治性（R/R）大细胞淋巴瘤（LBCL）患者接受嵌合抗原受体（CAR）T细胞会经历疾病的进展。在这种情况下，没有标准的下一步治疗和信息是稀缺和异质的。我们分析了387 R/R LBCL患者，他们从2018年7月至2022年3月在西班牙和英国进行了CAR T细胞的进展。中位总生存期（OS）为5.3个月，根据输注和进展之间的间隔（<2个月[1.9个月]，2-6个月[5.2个月]，> 6个月[未达到]）。进展后，237名（61％）患者接受了治疗。着重于首次治疗，Polatuzumab - Bendamustine - Rituximab（Pola）（Pola），双特异性抗体（BSAB）（BSAB）的总体（38％）为67％（38％），45％（35％）的51％（36％），用于放射线疗法（RADI），IIF（26％），33％（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％ （0％）为列纳莱度胺（LENA），化学疗法（CT）的25％（14％）。在生存方面，Pola的12个月进行生存，OS为36.2％和51.0％，BSAB为32.0％和50.1％，RT为30.8％和37.5％，ICI为29.9％和27.8％，ICI为7.3％和20.8％，Lena和6.1％和6.1％和18.3％的CT占CT。三十二名（14％）患者接受了同种异体造血细胞移植，其中位数后中位数为15.1个月后未达到中位OS。总而言之，在CAR T细胞疗法后的前2个月内进展的R/R LBCL患者会出现惨淡的结局。新型的靶向剂，例如polatuzumab和bsabs，可以在CAR T细胞治疗衰竭后长期生存。
进展到嵌合抗原受体T细胞疗法后大B细胞淋巴瘤患者的治疗结果
摘要超过60％的复发/难治性（R/R）大细胞淋巴瘤（LBCL）患者接受嵌合抗原受体（CAR）T细胞会经历疾病的进展。在这种情况下，没有标准的下一步治疗和信息是稀缺和异质的。我们分析了387 R/R LBCL患者，他们从2018年7月至2022年3月在西班牙和英国进行了CAR T细胞的进展。中位总生存期（OS）为5.3个月，根据输注和进展之间的间隔（<2个月[1.9个月]，2-6个月[5.2个月]，> 6个月[未达到]）。进展后，237名（61％）患者接受了治疗。着重于首次治疗，Polatuzumab - Bendamustine - Rituximab（Pola）（Pola），双特异性抗体（BSAB）（BSAB）的总体（38％）为67％（38％），45％（35％）的51％（36％），用于放射线疗法（RADI），IIF（26％），33％（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％）（26％ （0％）为列纳莱度胺（LENA），化学疗法（CT）的25％（14％）。在生存方面，Pola的12个月进行生存，OS为36.2％和51.0％，BSAB为32.0％和50.1％，RT为30.8％和37.5％，ICI为29.9％和27.8％，ICI为7.3％和20.8％，Lena和6.1％和6.1％和18.3％的CT占CT。三十二名（14％）患者接受了同种异体造血细胞移植，其中位数后中位数为15.1个月后未达到中位OS。总而言之，在CAR T细胞疗法后的前2个月内进展的R/R LBCL患者会出现惨淡的结局。新型的靶向剂，例如polatuzumab和bsabs，可以在CAR T细胞治疗衰竭后长期生存。
CRISPR/Cas9 介导的 TGFβRII 破坏增强人嵌合抗原受体 T 细胞的体外抗肿瘤功效
我们进行了一系列体外测试，以确定外源性 TGFβ 是否能对针对两种不同肿瘤抗原的 CAR T 细胞产生抑制作用。IVT 电穿孔 iDC（CLDN6/MSLN）与 CAR CLDN6 或 CAR MSLN T 细胞在增加 TGFβ 剂量的情况下共培养。添加的多种外源性 TGFβ（5-20 ng/ml）可显著抑制 CAR T 细胞在细胞因子分泌（图 2A）和增殖（图 2B）方面的功能，这与之前的报告一致。IFN-γ（最主要的免疫刺激性 T 细胞因子）的分泌非常容易受到即使添加的最低剂量 TGFβ 的影响，在没有 TGFβ 的情况下，IFN-γ 分泌会下降到不到 40%与此一致，即使在存在非常低剂量的 TGFβ（5ng/ml）的情况下，MSLN 和 CLDN6 特异性 CAR T 细胞的增殖也会降低到其天然增殖的 50% 以下（即不存在 TGFβ）。
在嵌合抗原受体T细胞疗法之前进行桥接放射疗法的结果
结果：在51例患者中，有25.5％的患有笨重的疾病，而64.7％的患者在RT时患有III/IV期。仅针对所有疾病部位的综合BRT均递送至51％的患者，而29.4％的患者则被全身治疗。中位随访时间为10.3个月（95％CI：7.7-16.4）。在卡尔-T输注后30天时，总体响应率（ORR）为82.4％。中位总生存期（OS）为22.1个月（6.6个未达到），中位无进展生存期（PFS）为7.4个月（5.5-30）。OS/PFS分别为1年的80％（66-99）/78％（64-87），分别为2年的59％（44-71）/54％（40-67）。综合的RT与疾病的所有部位有关，与改善的PFS和OS相关，P≤0.04。此外，ECOG≥2和III/IV期疾病预测OS差（P≤0.02）。疾病大量，IPI≥3和非GCB组织学是疾病的预测因子不良 -
基因组编辑供体来源的 T 细胞以产生同种异体嵌合抗原受体修饰的 T 细胞：优化 αβ T 细胞耗竭的单倍体相合细胞
1 美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院儿科系；2 美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物工程系；3 美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院细胞与基因医学实验室；4 丹麦奥胡斯大学生物医学系；5 丹麦奥胡斯大学奥胡斯高等研究院 (AIAS) 和 6 美国加利福尼亚州斯坦福大学干细胞生物学与再生医学研究所。
CD19嵌合抗原受体T细胞的功效和安全性在11例复发/难治性B细胞淋巴瘤治疗中：单中心
淋巴瘤治疗已进入免疫疗法时代。嵌合抗原受体（CAR）治疗是过去20年中开发的有前途的肿瘤继发性免疫细胞治疗方法之一。CAR修饰的T细胞（CAR T细胞）特异性地识别肿瘤细胞表面抗原，以避免内源性T细胞受到主要的组织相容性复合物的限制，这是一种有效的治疗方法，可以克服血液恶性肿瘤。基因设计的嵌合抗原受体T细胞（CAR TS）促进了具有更高精度的免疫疗法策略。CAR T允许T淋巴细胞通过遗传修饰表达特定的CAR，可以通过该修饰识别靶抗原并杀死靶细胞（11）。CAR T细胞与特定的肿瘤抗原具有很强的亲和力，并且可以有效地杀死表达相应抗原的肿瘤细胞。CD19在分化的不同阶段在B淋巴细胞表面特别表达。在正常组织中，CD19仅在成熟的B细胞，前体B细胞和浆细胞中表达，但是造血干细胞和非造血性干细胞不表达CD19。大多数B细胞恶性肿瘤细胞表达CD19，CD19抗原在超过95％的B细胞淋巴瘤病例中表达。因此，靶向CD19的CAR T细胞可用于治疗B细胞淋巴瘤（12,13）。