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蛋白酶体的小分子抑制剂可提高 CjCas9 蛋白的稳定性
CjCas9 体积小，更容易载体化用于体内基因治疗。然而，与 SpCas9 相比，CjCas9 在靶基因中产生插入/缺失的效率通常较低。影响其功效的因素尚未确定。我们观察到，在 CMV 启动子下将该转基因转染到 HEK293T 细胞后，CjCas9 蛋白的表达量远低于相同条件下的 SpCas9 蛋白。因此，我们评估了蛋白酶体抑制剂对 CjCas9 蛋白稳定性及其对 FXN 基因编辑效率的影响。Western 印迹显示，添加 MG132 或硼替佐米可显著提高 HEK293T 和 HeLa 细胞中的 CjCas9 蛋白水平。此外，硼替佐米增加了在比 CMV 弱但对某些组织具有特异性的启动子（如 CBH 或 EFS）下表达的 CjCas9 蛋白的水平。最后，ddPCR定量分析显示硼替佐米处理增强了CjCas9在HEK293T细胞中敲除FXN基因GAA重复序列的效率，CjCas9蛋白稳定性的提高有利于其在CRISPR/Cas系统中的应用。
利用链球菌进行体内多重基因靶向...
胰腺导管腺癌是一种致命的癌症类型，与体细胞中的多种基因突变有关。基因工程小鼠几乎不适用于开发胰腺癌模型，异种移植模型在反映早期胰腺癌方面存在局限性。因此，使用成簇的规律间隔的短回文重复序列进行体内体细胞基因工程用于生成胰腺癌动物模型越来越受到关注。在本研究中，我们选择了 Kras、Trp53、Ink4a、Smad4 和 Brca2 作为靶基因，并应用空肠弯曲菌 Cas9 (CjCas9) 和化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 通过腺相关病毒 (AAV) 转导来开发胰腺癌。在确认 AAV2 的多灶性和弥漫性转导后，我们生成了 SpCas9 过表达小鼠，该小鼠在两次 AAV 转导后表现出靶基因中高双链 DNA 断裂 (DSB) 和胰腺上皮内瘤变 (PanIN) 病变；然而，三次 AAV 转导的野生型 (WT) 小鼠没有出现 PanIN。此外，将小型 Cjcas9 应用于具有两个 AAV 系统的 WT 小鼠，该小鼠还出现了高广泛性 DSB 和 PanIN 病变。观察到了导管和胰岛细胞中的组织学变化和癌症标志物（如 Ki67、细胞角蛋白、Mucin5a、α 平滑肌肌动蛋白）的表达。此外，研究还揭示了几个发现，例如 1) AAV-CjCas9 的多重 DSB 潜力、2) 导管周围淋巴细胞浸润、3) 多灶性癌症标志物表达，以及 4) 在 AAV 介导的靶向中启动 PanIN 需要 12 个月以上。在这项研究中，我们提出了一种用于体内癌症建模的有用工具，该工具也适用于其他疾病模型。
通过Cas9增强位点特异性DNA集成...
CRISPR / CAS系统广泛用于基因组编辑。然而，强大的和有针对性的DNA段插入仍然是一个挑战。在这里，我们提出了一个融合核酸酶（CAS9-N57），以通过融合的DNA结合结构域增强位点DNA的整合，以使DNA片段将DNA段带到Cas9 / Sgrna络合物。插入是单向和特定的，并且长度长达12 kb的DNA片段已成功整合。作为对系统的测试，CAS9-N57在人类T细胞中插入CD19特异性嵌合抗基因受体（CD19卡）盒（CD19-CAR）盒中的AAVS1基因座，并通过同时发生的肌肉凝聚和肌肉凝聚在小鼠中，并诱导肌内胆管癌的位置，并促进了inscogen2的inscogen gecogenion inscogenion inscogenion inscogenion ogenition，破坏TRP53和PTEN。更重要的是，基于ASCPF1（ASCAS12A）和CJCAS9的Nuclease-N57融合蛋白表现出相似的活性。这些发现表明，CRISPR-核酸酶-N57蛋白融合是靶向DNA插入的强大工具，并且对基因治疗应用非常有用。
基因编辑技术的进展
随着大核酸酶、锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas 等工具的发展，精确修改人类基因的能力已经成为可能。这些技术现在使得产生靶向缺失、插入、基因敲除和点变异成为可能；通过将转录因子或表观遗传机制靶向 DNA 来调节基因表达；或靶向和修改 RNA。内源性修复机制用于对 DNA 进行所需的修改；它们包括非同源末端连接、同源性定向修复、同源性独立的靶向整合、微同源性介导的末端连接、碱基切除修复和错配修复。可以使用计算机预测和测序来监测脱靶效应，并使用具有更高精度的 Cas 蛋白（例如高保真度 Cas9、增强特异性 Cas9 和超精确 Cas9）将其最小化。已发现 Cas9 的替代品，包括 Cpf1、Cas12a、Cas12b 和较小的 Cas9 直系同源物（如 CjCas9）。基因编辑成分的递送是使用标准技术在体外进行，或使用 AAV、脂质纳米颗粒或细胞穿透肽在体内进行。基因编辑技术的临床开发正在多个领域取得进展，包括癌症治疗中的免疫疗法、HIV 感染的抗病毒疗法以及治疗遗传性疾病，如 b 地中海贫血、镰状细胞病、溶酶体贮积症和视网膜营养不良症。我们在此回顾这些技术进步及其临床实施面临的挑战。