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双质粒诱导型 CRISPR-Cas9 系统在拜氏梭菌中的改造及应用
CRISPR 技术的最新发展为改进梭菌属专用的基因组编辑工具开辟了新的可能性。在本研究中，我们改进了基于该技术的双质粒工具，以便对产生丙酮/丁醇/乙醇 (ABE) 或异丙醇/丁醇/乙醇 (IBE) 混合溶剂的两种拜氏梭菌参考菌株的基因组进行无瘢痕修饰。在 NCIMB 8052 ABE 生产菌株中，SpoIIE 孢子形成因子编码基因的失活导致孢子形成缺陷的突变体，并且通过用功能性 spoIIE 基因补充突变菌株可以恢复此表型。此外，将真菌纤维素酶编码 celA 基因插入拜氏梭菌 NCIMB 8052 染色体中，产生具有内切葡聚糖酶活性的突变体。接下来，我们采用类似的双质粒方法对天然 IBE 产生菌株 C. beijerinckii DSM 6423 的基因组进行编辑，该菌株此前从未进行过基因工程改造。首先，删除赋予甲砜霉素抗性的 catB 基因，使该菌株与我们的双质粒编辑系统兼容。作为概念验证，我们在 C. beijerinckii DSM 6423 Δ catB 中使用了我们的双质粒系统，以去除内源性 pNF2 质粒，从而大幅提高转化效率。
用于溶媒梭菌基因组和转录组工程的合成生物学工具
梭菌属菌株用于生产各种增值产品，包括燃料和化学品。任何商业上可行的生产工艺的开发都需要菌株和发酵工艺开发策略的结合。梭菌属的菌株开发可以通过随机诱变和靶向基因改造方法实现。然而，由于缺乏有效的基因组和转录组工程工具，通过靶向基因改造方法对梭菌属的菌株进行改良具有挑战性。最近，已经开发出各种合成生物学工具来促进产溶剂梭菌的菌株工程。在这篇综述中，我们整合了产溶剂梭菌基因组和转录组工程工具箱开发的最新进展。在这里，我们回顾了采用移动 II 组内含子、pyrE 等位基因交换和 CRISPR/Cas9 的基因组工程工具及其在梭菌属菌株开发中的应用。接下来，在梭菌菌株工程的背景下，还讨论了转录组工程工具，例如非翻译区 (UTR) 工程和合成 sRNA 技术。应用任何这些讨论的技术都将促进梭菌的代谢工程，以开发具有所需功能属性的改良菌株。这可能导致开发出一种经济可行的丁醇生产工艺，提高滴度、产量和生产率。
与人类考古遗迹有关的古代梭菌 DNA 和破伤风神经毒素变体
对人类考古样本中微生物基因组的分析提供了古代病原体的历史快照，并深入了解了现代传染病的起源。在这里，我们分析了来自 38 个人类考古样本的宏基因组数据集，并确定了与现代破伤风梭菌相关的细菌基因组序列，该梭菌会产生破伤风神经毒素 (TeNT) 并导致破伤风。这些基因组组装的完整性水平各不相同，其中一部分显示出古代 DNA 损伤的特征。系统发育分析揭示了已知的破伤风梭菌进化枝以及可能与破伤风梭菌密切相关的新梭菌谱系。基因组组装编码了 13 种具有独特替换谱的 TeNT 变体，包括仅在南美洲古代样本中发现的 TeNT 变体亚组。我们通过实验测试了从智利古代木乃伊样本中选出的 TeNT 变体，发现它会导致小鼠破伤风肌肉麻痹，其效力与现代 TeNT 相当。因此，我们的古代 DNA 分析在考古人类样本中发现了产神经毒素的破伤风梭菌 DNA，以及一种可导致哺乳动物患病的新型 TeNT 变体。
使用 CRISPR-Cas12a 对 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 进行多重基因组工程
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 8 月 23 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.08.22.504755 doi：bioRxiv 预印本
外源 β-葡萄糖苷酶的靶向整合增强了纤维素梭菌中的纤维素降解和乙醇生产
细菌 Clostridium cellulolyticum 是整合生物加工 (CBP) 的有希望的候选者。然而，需要进行基因工程来提高这种生物的纤维素降解和生物转化效率，以满足标准的工业要求。在本研究中，CRISPR-Cas9n 用于将高效的 β -葡萄糖苷酶整合到 C. cellulolyticum 的基因组中，破坏乳酸脱氢酶 ( ldh ) 表达并降低乳酸产量。与野生型相比，工程菌株的 β -葡萄糖苷酶活性增加了 7.4 倍，ldh 表达减少了 70%，纤维素降解增加了 12%，乙醇产量增加了 32%。此外，ldh 被确定为异源表达的潜在位点。这些结果表明，同时进行 β -葡萄糖苷酶整合和乳酸脱氢酶破坏是提高 C. cellulolyticum 中纤维素到乙醇的生物转化率的有效策略。
通过基于 Cas12a 的 CRISPR 干扰对溶剂产气梭菌进行单基因和多基因抑制
构成梭菌属的革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧厚壁菌种具有广泛的原料消耗能力并产生增值代谢产物，但基因操作困难，限制了它们的广泛吸引力。CRISPR-Cas 系统最近已应用于梭菌种，主要使用 Cas9 作为反选择标记与基于质粒的同源重组结合。CRISPR 干扰是一种通过精确靶向核酸酶缺陷型 Cas 效应蛋白来降低特定基因表达的方法。在这里，我们开发了一种基于 dCas12a 的 CRISPR 干扰系统，用于抑制多种中温梭菌种的转录基因。我们表明，与源自其他细菌的 CRISPR Cas 系统相比，由于梭菌种中的 GC 含量低，基于新凶手弗朗西斯菌 Cas12a 的系统具有更广泛的适用性。我们证实，丙酮丁醇梭菌中靶基因的转录水平降低了 99% 以上，巴氏梭菌中靶基因的转录水平降低了 75% 以上。我们还通过使用单个合成 CRISPR 阵列证实了多重抑制，靶基因表达降低了 99%，并阐明了其表达降低的独特代谢特征。总体而言，这项工作为无需基因编辑的高通量遗传筛选奠定了基础，而基因编辑是梭菌群落当前使用的筛选方法的一个关键限制。
针对改良的梭状芽胞杆菌肠毒素靶向过表达甲状腺和肺癌
灌注梭菌肠毒素（CPE）可用于消除过表达其细胞表面CPE受体的癌细胞 - Claudins的子集（例如CLDN3和CLDN4）。但是，CPE不能靶向仅表达CPE不敏感的Claudins（例如CLDN1和CLDN5）的肿瘤。为了克服这一限制，结构引导的修改被用来结合CPE变体，这些变体可以与CLDN1，CLDN2和/或CLDN5强烈结合，同时保持结合CLDN3和CLDN4的能力。启用（a）靶向最常见的内分泌恶性肿瘤，即CLDN1-Over-over表达甲状腺癌，以及（b）改善针对全球最常见的癌症类型，非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的癌症类型，这是由多种Claudins（包括Claudins）高表达Clddn1和Clddn1和Claudins的高度表达。 在甲状腺癌（K1细胞）和NSCLC（PC-9细胞）模型上应用了不同的CPE变体，包括新型突变体CPE-MUT3（S231R/ S313H）。 在体外，CPE-MUT3而不是CPEWT显示出对K1细胞的CLDN1依赖性结合和细胞毒性。 对于PC-9细胞，与CPEWT相比，CPE-MUT3改善了Claudin依赖性细胞毒性靶向。 在体内，具有K1或PC-9肿瘤的异种移植模型中肿瘤内注射CPE-MUT3可诱导坏死，并降低了两种肿瘤类型的生长。 因此，CPE的定向修改可以消除CPEWT无法靶向的肿瘤实体，例如，使用新颖的CPE-MUT3，CLDN1-过表达甲状腺癌。启用（a）靶向最常见的内分泌恶性肿瘤，即CLDN1-Over-over表达甲状腺癌，以及（b）改善针对全球最常见的癌症类型，非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的癌症类型，这是由多种Claudins（包括Claudins）高表达Clddn1和Clddn1和Claudins的高度表达。在甲状腺癌（K1细胞）和NSCLC（PC-9细胞）模型上应用了不同的CPE变体，包括新型突变体CPE-MUT3（S231R/ S313H）。在体外，CPE-MUT3而不是CPEWT显示出对K1细胞的CLDN1依赖性结合和细胞毒性。 对于PC-9细胞，与CPEWT相比，CPE-MUT3改善了Claudin依赖性细胞毒性靶向。 在体内，具有K1或PC-9肿瘤的异种移植模型中肿瘤内注射CPE-MUT3可诱导坏死，并降低了两种肿瘤类型的生长。 因此，CPE的定向修改可以消除CPEWT无法靶向的肿瘤实体，例如，使用新颖的CPE-MUT3，CLDN1-过表达甲状腺癌。在体外，CPE-MUT3而不是CPEWT显示出对K1细胞的CLDN1依赖性结合和细胞毒性。对于PC-9细胞，与CPEWT相比，CPE-MUT3改善了Claudin依赖性细胞毒性靶向。在体内，具有K1或PC-9肿瘤的异种移植模型中肿瘤内注射CPE-MUT3可诱导坏死，并降低了两种肿瘤类型的生长。因此，CPE的定向修改可以消除CPEWT无法靶向的肿瘤实体，例如，使用新颖的CPE-MUT3，CLDN1-过表达甲状腺癌。
改良产气荚膜梭菌肠毒素靶向 claudin 过度表达的甲状腺癌和肺癌
产气荚膜梭菌肠毒素 (CPE) 可用于消除细胞表面 CPE 受体（一种 claudins 亚群，例如 Cldn3 和 Cldn4）过表达的癌细胞。但是，CPE 无法靶向仅表达 CPE 不敏感 claudins（例如 Cldn1 和 Cldn5）的肿瘤。为了克服这一限制，使用结构引导修饰来生成可以与 Cldn1、Cldn2 和/或 Cldn5 强结合的 CPE 变体，同时保持与 Cldn3 和 Cldn4 结合的能力。这使得 (a) 能够靶向最常见的内分泌恶性肿瘤，即 Cldn1 过表达的甲状腺癌，以及 (b) 能够更好地靶向全球最常见的癌症类型，即非小细胞肺癌 (NSCLC)，该类型的特点是高表达几种 claudins，包括 Cldn1 和 Cldn5。不同的 CPE 变体，包括新型突变体 CPE-Mut3 (S231R/S313H)，被应用于甲状腺癌 (K1 细胞) 和 NSCLC (PC-9 细胞) 模型。体外实验中，CPE-Mut3 而非 CPEwt 表现出对 K1 细胞的 Cldn1 依赖性结合和细胞毒性。对于 PC-9 细胞，与 CPEwt 相比，CPE-Mut3 改善了紧密连接蛋白依赖性的细胞毒性靶向性。体内实验中，在带有 K1 或 PC-9 肿瘤的异种移植模型中瘤内注射 CPE-Mut3 可诱导坏死并减缓两种肿瘤类型的生长。因此，通过使用新型 CPE-Mut3，定向修饰 CPE 能够消灭 CPEwt 无法靶向的肿瘤实体，例如过表达 Cldn1 的甲状腺癌。
牛轮状病毒冠状病毒疫苗、灭活病毒、产气荚膜梭菌 C 和 D-大肠杆菌菌苗-类毒素
腹泻疫苗提供全面保护。GUARDIAN® 是一种完整的新生儿腹泻（腹泻）疫苗，具有广泛的抗原，与断奶前奶牛腹泻的四种主要细菌和病毒病因有关，包括：• 轮状病毒 G6 型和 G10 型 • 冠状病毒 1 型和 3 型 • 产气荚膜梭菌 C 型和 D 型 • 大肠杆菌 K99 型 给干奶牛和妊娠后期小母牛接种 GUARDIAN 可提高其初乳中的抗体浓度，结合初乳管理可减少或消除给单个小牛接种疫苗的需要。
乙酰杆菌中的基因组工程内源性CRISPR/CAS系统，乙酰杆菌和梭状芽胞杆菌自动乙醇
乙细菌可以通过将CO 2转换为工业相关的化学物质和燃料的能力来在净零中发挥重要作用。对该潜力的全面开发将依靠有效的代谢工程工具，例如基于链球菌的链球菌CRISPR/CAS9系统的工具。然而，试图将含Cas9的载体引入木质杆菌的尝试不成功，这很可能是由于Cas9核酸酶毒性的毒性，并且存在内源性a。Woodii限制的识别位点 - cas9 Gene中的Modiiii限制（R -M）系统。作为替代方案，本研究旨在促进将CRISPR/CAS内源系统作为基因组工程工具的开发。因此，开发了一个Python脚本，以自动化杂质的邻近基序（PAM）序列的预测，并用于识别A. woodii I型I型I-B CRISPR/CAS系统的PAM候选。分别通过干扰测定和RT-QPCR在体内表征识别的PAM和本地领导者序列。由本机领导者序列，直接重复和足够的间隔者组成的合成CRISPR阵列的表达，以及用于同源重组的编辑模板，成功地导致了300 bp和354 bp的生成Pyre和Pye和PheA的架子内缺失。为了进一步验证该方法，还产生了3.2 kb的HSDR1缺失，以及在PHEA基因座的荧光激活和吸收转换TAG（快速）报告基因的敲入。同源臂长度，细胞密度和用于转化的DNA量显着影响编辑的效率。随后将设计的工作流应用于梭状芽胞杆菌的I型I-B CRISPR/CAS系统，从而使Pyre的561 bp框架内缺失具有100％的编辑效率。这是使用其内源性CRISPR/CAS系统的A. woodii和C.自身乙烷的基因组工程的第一个报告。