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利用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白高效生成同源原代人类髓系细胞
摘要 使用 CRISPR-Cas9 对原代人类细胞进行基因组工程改造彻底改变了细胞生物学的实验和治疗方法，但人类髓系细胞在遗传上仍然难以治疗。我们提出了一种通过核转染将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物直接递送到从外周血纯化的 CD14+ 人类单核细胞中的方法，从而实现高精确基因敲除率。这些细胞可以有效分化为单核细胞衍生的巨噬细胞或树突状细胞。该过程产生的基因编辑细胞保留了髓系分化和吞噬功能的关键标记。限制因子 SAMHD1 的基因消融使 HIV-1 感染增加了 50 多倍，证明了该系统在基因型-表型查询方面的强大功能。这种快速、灵活且可扩展的平台可用于人类髓系细胞在免疫信号、炎症、癌症免疫学、宿主-病原体相互作用等方面的遗传研究，并可促进新型髓系细胞疗法的开发。简介髓系细胞是健康和疾病免疫系统中的关键参与者（Germic 等人，2019 年；Lapenna 等人，2018 年；Worbs 等人，2017 年）。单核细胞和巨噬细胞在先天免疫系统的直接分支中发挥作用，对病原体或组织损伤作出反应，并帮助调节和解决组织炎症。作为专业的抗原呈递细胞，树突状细胞可协调适应性免疫反应。鉴于髓系细胞的核心作用，髓系细胞被确定为从发育和稳态调节到病原体反应、自身炎症性疾病、纤维化和恶性肿瘤等各个方面的关键参与者也就不足为奇了 (Chao 等人，2020 年；Engblom 等人，2016 年；Manthiram 等人，2017 年；Medzhitov 和 Janeway，2000 年、1997 年；Wynn 等人，2013 年)。更好地了解这些细胞的正常行为和致病行为对于进一步加深我们对各种疾病的机制理解至关重要，为发现和发展新疗法带来了希望。我们识别新治疗靶点和构建新细胞干预措施的能力与我们对相关原代细胞类型的基因操作能力同步发展。例如，小鼠基因方法揭示了小鼠巨噬细胞的显著多样性，而骨髓亚群的基因消融为临床中类似细胞的治疗靶向铺平了道路（Wynn 等人，2013 年）。CRISPR-Cas9 介导的基因靶向显著扩展了曾经难以治疗的细胞类型的潜力，促进了重要的发现工作和增强的原代 T 细胞细胞治疗方法（Roth 等人，2018 年；Schumann 等人，2015 年；Simeonov 和 Marson，2019 年；Stadtmauer 等人，2020 年），以及使用编辑的造血干细胞/祖细胞治疗衰弱性遗传疾病（Foss 等人，2019 年；Wu 等人，2019 年）。到目前为止，CRISPR-Cas9 在原代人类髓系细胞中效率低下，限制了人类免疫系统这些关键细胞的功能遗传学研究和基因组工程。已鉴定出 SAMHD1 是髓系细胞中阻止有效慢病毒转导的关键限制因子（Hrecka 等人，2011 年；Laguette 等人，
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注释 [1] 标准化学式代表理想燃料。某些表值以范围表示，以代表现场遇到的典型燃料变化。 [2] GGE 表值反映了常见汽油基线参考（E0、E10 和吲哚认证燃料）的 Btu 范围。 [3] 必须考虑用于给车辆加油的仪表或分配设备的类型。对于使用科里奥利流量计分配 CNG 的快速加气站，这些流量计测量燃料质量并根据 GGE 报告分配的燃料，应使用磅/GGE 因子。对于按时加气站或使用以立方英尺为单位测量/记录的传统住宅和商业燃气表的其他应用，应使用 CF/GGE 因子。 [4] 请参阅压缩天然气汽油和柴油加仑当量方法，网址为 http://afdc.energy.gov/fuels/equivalency_methodology.html。 [5] E85 是一种高浓度汽油-乙醇混合物，乙醇含量为 51% 至 83%，具体比例取决于地理位置和季节。在寒冷气候下，冬季的乙醇含量较低，以确保车辆能够启动。根据成分，E85 的低热值从 83,950 到 95,450 Btu/加仑不等。[6] 锂离子电池密度为 400 Wh/l，摘自 Linden 和 Reddy 的《电池手册》，第 3 版，麦格劳-希尔出版社，纽约，2002 年。[7] 用于运输时，锂离子能量密度增加了 3.4 倍，以解释电动汽车传动系统相对于内燃机的效率提高。资料来源 (a) NIST 手册 44 – 质量流量计附录 E https://www.nist.gov/file/323701 (b) 第 78 届全国度量衡大会报告，1993 年，NIST 特别出版物 854，第 322-326 页。https://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/Legacy/SP/nistspecialpublication854.pdf (c) 交通运输中的温室气体、管制排放和能源使用 (GREET) 模型。2023 年。输入燃料规格。阿贡国家实验室。伊利诺伊州芝加哥。 https://greet.es.anl.gov/ (d) R. McCormick 和 K. Moriarty，《生物柴油处理和使用指南 - 第六版》，美国国家可再生能源实验室 (NREL)，2023 年。https://afdc.energy.gov/files/u/publication/biodiesel_handling_use_guide.pdf (e) 美国石油协会 (API)，《醇和醚》，出版物编号 4261，第 3 版。（华盛顿特区，2001 年 6 月），表 2。 (f) 《石油产品调查：车用汽油》，1986 年夏季，1986/1987 年冬季。国家石油和能源研究所。 (g) 美国石油协会 (API)，《醇和醚》，出版物编号 4261，第 3 版。（华盛顿特区，2001 年 6 月），表 B-1。 (h) K. Owen 和 T. Coley。1995 年。《汽车燃料参考书：第二版》。美国汽车工程师协会。宾夕法尼亚州沃伦代尔。https://www.osti.gov/biblio/160564-automotive-fuels-reference- book-second-edition (i) J. Heywood。1988 年。《内燃机基础知识》。麦格劳-希尔公司。纽约。(j) 甲醇研究所。纯甲醇的物理性质。访问于 2024 年 3 月 14 日，网址为 https://www.methanol.org/wp-content/uploads/2016/06/Physical-Properties-of-Pure-Methanol.pdf (k) Foss, Michelle。2012 年。液化天然气安全与保障。经济地质局、杰克逊地球科学学院。德克萨斯大学奥斯汀分校。 (l) 能源信息管理局。“能源使用解释：运输能源使用。” https://www.eia.gov/energyexplained/use-of-energy/transportation.php (m) J. Sheehan、V. Camobreco、J. Duffield、M. Graboski 和 H. Shapouri。1998 年。生物柴油和石油柴油生命周期概述。NREL 和美国能源部 (DOE)。NREL/TP-580-24772。 https://www.nrel.gov/docs/legosti/fy98/24772.pdf (n) M. Wang。2005 年。燃料乙醇对能源和温室气体排放的影响。向 NGCA 可再生燃料论坛发表的演讲。阿贡国家实验室。伊利诺伊州芝加哥。https://www.researchgate.net/publication/228787542_Energy_and_greenhouse_gas_emissions_impacts_of_fuel_ethanol