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使用 TrueDesign 基因组编辑器中的长插入工作流程将 GFP 序列插入 TRAC 基因座
8. TrueDesign 基因组编辑器将显示优先设计为最接近预期编辑位置（最多 40 bp 距离）的 gRNA 和供体 DNA。gRNA 距离编辑位置越远，敲入效率越低。所有设计的供体 DNA 序列（现在包括同源臂）都将接受 GeneArt 基因合成制造可行性检查。如果供体 DNA 未通过检查，您将无法选择该 gRNA，并且该行将变灰。在这种情况下，请选择不同的 gRNA 或 TALEN 对（如果可用），或更改插入位置或同源臂长度。对于每个 CRISPR-Cas9 gRNA 和 TALEN 对，可以通过单击供体 DNA 列中的眼睛图标来查看供体 DNA 序列。要在您选择的克隆软件中查看和注释供体 DNA 序列，请单击供体 DNA 列中的下载图标下载 FASTA 文件。确保供体 DNA 位于框架内以实现 GFP 的最佳表达。
Cas9 核酸酶 GFP NLS 蛋白
产品描述 成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 系统是基因组编辑中最新的 RNA 引导核酸内切酶工具，可实现非常具体的基因组破坏和替换。Cas9 核酸酶 NLS 与 GFP 的融合可实现转染的视觉确认以及随后的 Cas9 从细胞中清除的验证。Cas9 核酸酶-GFP 也可用于 FACS 应用和筛选。Cas9 核酸酶-GFP NLS 在蛋白质的 C 端包含 SV40 T 抗原核定位序列 (NLS)。
通过恢复 GFP 活性来优化水稻、花生、鹰嘴豆和豇豆原生质体中的 Prime Editing
摘要：植物基因组的精确编辑一直是功能基因组研究和作物育种的迫切需要。Prime 编辑是一种新开发的基于 CRISPR-Cas9 的精确编辑技术，它使用工程逆转录酶 (RT)、催化受损的 Cas9 内切酶 (nCas9) 和 Prime 编辑向导 RNA (pegRNA)。此外，Prime 编辑比碱基编辑具有更广泛的编辑类型，可以产生几乎所有类型的编辑。虽然 Prime 编辑最早是在人类细胞中建立的，但它最近才被应用于植物。作为一种相对较新的技术，需要进行优化以提高不同作物的编辑效率。在本研究中，我们成功地编辑了水稻、花生、鹰嘴豆和豇豆原生质体中的突变体 GFP。在水稻中，双 pegRNA 的编辑效率比单 pegRNA 载体高出 16 倍。用双 pegRNA 载体转化花生、鹰嘴豆和豇豆后，也获得了编辑突变的 GFP 原生质体，尽管编辑效率比水稻低得多，范围从 0.2% 到 0.5%。这些初步结果有望加快在豆科植物育种计划中应用主要编辑，以加速作物改良。
GFP转基因恒河猴的克隆和碱基编辑...
我们报告了通过体细胞核移植 (SCNT) 和胚胎碱基编辑克隆了一只 12 岁的转基因绿色荧光蛋白 (GFP) 猴，同时对腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 进行了安全性评估。我们首先展示了 ABEmax 通过在 293T 细胞中对 GFP 序列进行 A 到 G 编辑来沉默 GFP 的能力。随后，使用表达 GFP 的猴子的供体细胞，我们成功生成了 207 个 ABEmax 编辑 (SCNT-ABE) 和 87 个野生型 (SCNT) 胚胎，用于胚胎移植、基因分型以及基因组和转录组分析。使用一种名为 OA-SCNT 的新方法，对 SCNT-ABE 和 SCNT 胚胎进行比较以进行脱靶分析，而无需遗传变异的干扰。在编辑的猴胚胎中，ABEmax 不会诱导明显的脱靶 DNA 突变，但会诱导广泛的脱靶 RNA 突变，其中 35% 是外显子。研究结果为ABE的临床应用提供了重要参考。
一种快速对基因进行 GFP 标记并富集编辑细胞的方法
图 1. 供体 DNA 模板设计。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供用于 (A) N 端标记或 (B) C 端标记目标基因的 PCR 模板。具有短同源臂 (HA) 序列的位点特异性引物用于 PCR 扩增以生成供体 DNA 分子。通过 CRISPR-Cas9 或 TALEN ™ 系统切割目标位点后，供体 DNA 在 HDR 过程中整合到基因组中。2A 自切割肽 (2A) 允许选择标记 (嘌呤霉素或杀稻瘟素) 和标记基因从内源启动子表达。每个模板的通用引发序列 (Uni) 允许轻松设计 PCR 引物。
Cav-1 :: GFP在C. exkemans中的内源表达和定位
小窝蛋白是负责形成口洞的整体膜蛋白，与各种疾病状态相关的质膜的内陷（Parton等人2020）。在秀丽隐杆线虫中，有两个小窝蛋白Cav-1和cav-2。CAV-1基因与所有三个哺乳动物小窝蛋白基因共享同源性（Tang等人1997）。 秀丽隐杆线虫Cav-1蛋白似乎并不形成小窝，但是Cav-1和Cav-2的双敲击突变体会影响产卵，而Cav-1的敲低会影响动态突变体背景中的运动（Parker等人 。 2007，Kirkham等。 2008，Sato等。 2008）。 基于外源表达，Cav-1 :: GFP众所周知，众所周知，卵形颗粒和质膜中的质膜和早期胚胎，在后来的胚胎中，质膜，以及幼虫和成人蠕虫中的神经肌肉系统（Sato等）（Sato等。 2006，Bembenek等。 2007，Parker等。 2007）。1997）。秀丽隐杆线虫Cav-1蛋白似乎并不形成小窝，但是Cav-1和Cav-2的双敲击突变体会影响产卵，而Cav-1的敲低会影响动态突变体背景中的运动（Parker等人。2007，Kirkham等。 2008，Sato等。 2008）。 基于外源表达，Cav-1 :: GFP众所周知，众所周知，卵形颗粒和质膜中的质膜和早期胚胎，在后来的胚胎中，质膜，以及幼虫和成人蠕虫中的神经肌肉系统（Sato等）（Sato等。 2006，Bembenek等。 2007，Parker等。 2007）。2007，Kirkham等。2008，Sato等。 2008）。 基于外源表达，Cav-1 :: GFP众所周知，众所周知，卵形颗粒和质膜中的质膜和早期胚胎，在后来的胚胎中，质膜，以及幼虫和成人蠕虫中的神经肌肉系统（Sato等）（Sato等。 2006，Bembenek等。 2007，Parker等。 2007）。2008，Sato等。2008）。 基于外源表达，Cav-1 :: GFP众所周知，众所周知，卵形颗粒和质膜中的质膜和早期胚胎，在后来的胚胎中，质膜，以及幼虫和成人蠕虫中的神经肌肉系统（Sato等）（Sato等。 2006，Bembenek等。 2007，Parker等。 2007）。2008）。基于外源表达，Cav-1 :: GFP众所周知，众所周知，卵形颗粒和质膜中的质膜和早期胚胎，在后来的胚胎中，质膜，以及幼虫和成人蠕虫中的神经肌肉系统（Sato等）（Sato等。2006，Bembenek等。 2007，Parker等。 2007）。2006，Bembenek等。2007，Parker等。 2007）。2007，Parker等。2007）。2007）。
ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶
ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶是一种融合蛋白，由增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 和来自化脓性链球菌的野生型 Cas9 重组蛋白组成；它包含一个 C 端连接的 eGFP 分子。ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶需要与向导 RNA（例如 ArciTect™ sgRNA（目录号 #200-0013）或由 ArciTect™ tracrRNA（目录号 #76016）和 ArciTect™ crRNA（目录号 #76010）组成的双链）结合，以形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。该 RNP 复合物在基因组中的位点特定位置产生双链断裂。 ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶还在 N 端含有核定位信号，确保 RNP 复合物转位至细胞核，从而提高基因组编辑的效率。由于 RNP 复合物在转染后完全发挥作用，因此在转位至细胞核后可立即发挥作用。RNP 复合物在 48 小时内降解，为基因组编辑提供了充足的时间，同时减少了 RNP 复合物持续存在可能导致的脱靶效应。使用 RNP 系统还可以避免生成稳定的 Cas9 表达细胞系的繁琐过程，从而节省时间并降低由于可诱导表达系统泄漏而导致脱靶效应的风险。化脓性链球菌 Cas9 使用原间隔区相邻基序 (PAM) 序列 NGG（其中 N 可以是任何核苷酸）。如果靶序列下游没有基因组 PAM 位点，酶就不会裂解。
AccuTool™ sgRNA-(GFP) 合成 (dRGEN)
DNA 引导的 RNA 引导内切酶 (dRGEN) 是高效、经济且方便的基因组编辑实验工具。AccuTool™ dRGEN 可识别长度为 23 bp 并以两个鸟嘌呤 (GG) 结尾的目标序列。定制 sgRNA 表达质粒可与 Cas9 表达质粒（人类密码子优化，WT/Nickase/Sniper 形式可用）一起使用。质粒可以通过任何标准方法（如脂质转染、纳米颗粒或电穿孔）递送到您感兴趣的细胞中，以实现高效递送。sgRNA-GFP 表达质粒是通过将 GFP 构建体插入现有 sgRNA 质粒中构建的。sgRNA-GFP 表达质粒可让您通过荧光显微镜确认细胞中的活性水平。 AccuTool™ dRGEN 是一种定制设计的 sgRNA，以 sgRNA 表达质粒或 sgRNA-GFP 表达质粒的形式提供。应用
通过GFP-Reporter测定法恢复单切SGRNA的敏感且可靠的评估
大多数Duchenne肌肉营养不良（DMD）病例是由一个或多个外显子的删除或重复引起的，这些外显子破坏了DMD mRNA的阅读框架。恢复阅读框允许产生部分功能性肌营养不良蛋白，并导致症状不太严重。反义寡核苷酸介导的外显子跳过已被批准用于DMD，但是该策略需要重复治疗。crispr/cas9还可以恢复室内读取框架。尽管最近的体内研究表明单切换/外显子跳过策略的功效，但缺乏找到特定突变的最有效的单切SGRNA的方法。在这里，我们表明插入/删除（Indel）产生效率和Indel曲线都有助于读取框架恢复单切SGRNA的效率，因此只检查Indel频率的测定无法找到最佳的SGRNA。因此，我们开发了一种GFP重复蛋白测定法，以评估单切性效率，并报告了这两个方面的综合效应。我们表明，GFP-Reporter分析可以可靠地预测肌细胞中SGRNA的性能。此GFP-报告基因测定法可以有效，可靠地找到最有效的单切SGRNA来恢复肌营养不良蛋白的表达。
利用 CRISPR/Cas9 介导的靶向整合生成 Y 染色体中含有 EGFP 基因的转基因克隆水牛胚胎
性别控制技术在家畜生产中具有重要意义，尤其对于快速繁殖的水牛（bubalus bubalis）具有重要意义，本研究以水牛为研究模型。我们已证实整合到小鼠Y染色体上的荧光蛋白可用于小鼠植入前胚胎的性别鉴定。首先，我们优化了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和mCherry外源基因在Neuro-2a细胞、小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎细胞（NIH3T3）、水牛胎儿成纤维细胞（BFF）中的靶向整合效率。结果表明，靶标两侧同源臂长度为800 bp比300 bp或300 bp/800 bp更有效。当细胞补充了 pifithrin-µ（一种抑制 p53 与线粒体结合的小分子）时，BFF 细胞中同源定向修复 (HDR) 介导的敲入也得到了显著改善。250 V 的三个脉冲在 BFF 细胞中产生最有效的电穿孔，并且发现 1.5 µ g/mL 嘌呤霉素是筛选的最佳浓度。此外，利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑结合体细胞核移植 (SCNT) 技术成功生成了 Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞和克隆水牛胚胎。在第 6-8 代时，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞的生长率和细胞增殖率明显低于非转基因 BFF 细胞；甲基化相关基因 DNMT1 和 DNMT3a 的表达水平相似；然而，与非转基因细胞相比，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞中乙酰化相关基因 HDAC1 、 HDAC2 和 HDAC3 的表达水平显著较高（p < 0.05）。Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 被用作 SCNT 的供体，结果表明 eGFP 报告基因适用于胚胎性别的可视化。克隆水牛胚胎的囊胚率相似；然而，与对照相比，转基因克隆胚胎的卵裂率明显较低。总之，我们优化了产生转基因 BFF 细胞的方案，并使用这些细胞作为供体成功产生了 Y-Chr-eGFP 转基因胚胎。