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Issatchenkia Orientalis
图1。SD108中全基因组整合位点的硅筛选算法算法。 （a）用于ICAS9介导的整合的基因基因座中的GRNA。 扫描基因组以获取“ NGG” PAM以获得指南RNA库。 筛选GRNA以最大程度地减少潜在的脱靶，并根据其基因组位置过滤。 （b）纳入各种因素以优先考虑基因组基因局进行实验筛查。 GRNA及其相应的同源臂是根据寡核苷酸合成和质粒克隆标准来完善的。 设计规则是通过避免调节元素的破坏和包括基因本质信息的中断来确保应变稳定性的，而基因密度则是添加基因密度作为开放染色质的代理。 转录组数据纳入了接近转录活性基因的选择位置。算法。（a）用于ICAS9介导的整合的基因基因座中的GRNA。扫描基因组以获取“ NGG” PAM以获得指南RNA库。筛选GRNA以最大程度地减少潜在的脱靶，并根据其基因组位置过滤。（b）纳入各种因素以优先考虑基因组基因局进行实验筛查。GRNA及其相应的同源臂是根据寡核苷酸合成和质粒克隆标准来完善的。设计规则是通过避免调节元素的破坏和包括基因本质信息的中断来确保应变稳定性的，而基因密度则是添加基因密度作为开放染色质的代理。转录组数据纳入了接近转录活性基因的选择位置。
引言 结论 披露 结果
• 我们在此描述了离子交换色谱和内在荧光分析方法的开发，以帮助表征 RNP 复合体 • 在 gRNA：Cas 比率 ≥ 1 时，单体和二聚体 apo-gRNA 中未复合蛋白质的量达到不同的平台期。动力学建模表明二聚化影响平台期的水平，但可能不能完全解释观察到的平台期行为 • 内在蛋白质荧光光谱可以以无标记的方式探测 gRNA 复合体，并显示单体和二聚体 gRNA 之间的区别 • 了解这些非共价 RNP 复合物的结构和功能之间的关系是优化细胞编辑过程以及将这些化合物表征为治疗剂的关键
利用 CRISPR/Cas9 系统在猪胚胎中表达 cd163
摘要 基因编辑 (GE) 在养猪生产中的应用可以产生广泛的影响，因为它可以增加基因编辑猪在农业和生物医药中的可用性。成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统的最新应用有望提高基因编辑的效率。CRISPR/Cas9 系统的细胞质微注射能够在猪受精卵中诱导位点特异性突变。在本研究中，我们检查了通过细胞质微注射将 CRISPR/Cas9 蛋白和分化簇 163 (cd163) 引导 RNA (gRNA) 成分引入受精卵的效率。CRISPR/Cas9 蛋白和 cd163 gRNA 注射组的裂解率 (78.9% 和 85.2%) 与对照组 (90.6%) 在统计学上相似。此外，CRISPR/Cas9 蛋白和 cd163 gRNA 注射组的囊胚形成率（19.9% 和 19.6%）也与对照组（21.5%）具有统计学差异。当对单个囊胚进行基因分型时，我们在后续的囊胚中观察到基因的靶向修饰。在 10 ng/ul 样本中，CRISPR/Cas9 蛋白和 cd163 (10+134) gRNA 各注射组（22.7%）显著高于（p<0.05）CRISPR/Cas9 蛋白和 cd163(10) gRNA 各注射组（12.9%）。在突变囊胚中检测到了各种类型的 indel 突变，包括 4 bp 缺失到 72 bp 插入。这些结果表明，CRISPR/Cas9 技术可用于通过直接受精卵注射生产基因编辑猪。
本氏烟羟化酶亚家族
图 1 本研究针对的四种脯氨酰-4-羟化酶-4 ( NbP4H4 ) 基因、用于靶向它们的 gRNA 以及显示关键元素的二元载体 pBV113 的一部分的示意图。基因以示意图形式绘制，左下图中扩大了前三个外显子（框）和内含子（虚线），以显示八个 gRNA 的靶位。G3（红色）靶向所有四个基因，而其他七个基因（G1、G2、G5 和 G6 为绿色，表示它们未用于稳定转化实验，G4 为蓝色，G7 为粉色，G8 为橙色）则特定于 NbP4H4_1 和 NbP4H4_2 。右下图显示了二元载体 pBV113 的一部分，其中显示了 NbP4H4_1 中 gRNA 位点周围的关键元素。包含 G3 的编辑盒由黄叶卷曲病毒 (CmYLCV) 启动子驱动，并插入二元载体的 SapI 位点。处理系统包括 Csy4 位点以及优化的 gRNA 支架 (osgRNA)
CriSNPr，一种使用多种 Cas 系统对 CRISPR 诊断的 gRNA 进行精选和从头设计的单一界面
摘要 基于 CRISPR 的诊断技术 (CRISPRDx) 通过检测核酸和识别变异体改善了临床决策，尤其是在 COVID-19 大流行期间。新型和工程化的 CRISPR 效应子的发现加速了这一进程，它们扩大了诊断应用的范围，涵盖了广泛的致病和非致病条件。然而，每个诊断 CRISPR 流程都需要根据所用 Cas 蛋白的基本原理、其向导 RNA (gRNA) 设计参数和检测读数定制检测方案。这对于变异检测尤其重要，变异检测是基于测序方法的低成本替代方法，目前尚无用于 CRISPRDx 即用型设计的计算机模拟流程。在本文中，我们使用统一的 Web 服务器 CriSNPr（基于 CRISPR 的 SNP 识别）填补了这一空白，它为用户提供了基于六种 CRISPRDx 蛋白（Fn /en Fn Cas9、Lw Cas13a、Lb Cas12a、Aa Cas12b 和 Cas14a）从头设计 gRNA 的机会，并查询可用于验证相关样本的即用型寡核苷酸序列。此外，我们还提供了一个精选的预先设计的 gRNA 数据库以及迄今为止报告的所有人类和 SARS-CoV-2 变体的靶标/脱靶数据库。CriSNPr 已在多种 Cas 蛋白上得到验证，证明了其在多个检测平台上广泛且直接的适用性。CriSNPr 可在 http://crisnpr.igib.res.in/ 找到。
crispr-tsko的金门装配
在第一步中，将六个金门入口向量合并为目标向量。有各种可以使用的金门目标向量，其中包含可以使用的不同植物和/或视觉标记物（请参阅补充数据集1中的金门目标矢量（CCDB +）1）。第一个入口向量（AB）包含组织特异性表达的启动子。第三个入口矢量（CD）包含核酸酶，可以与N末端（BC）或C末端标签（DE）结合使用。另外，如果不需要标签，则使用链接序列。第五入口矢量（EF）包含工厂终结器。选择的第六个黄金入口向量（FG）取决于最终目标。要克隆与一个或两个GRNA兼容的矢量，请使用未武装的GRNA进入矢量PGG-F-F-ATU6-26-AARI-AARI-AARI-G（请参阅补充数据集1中的未武装GRNA进入向量1）。要克隆与多个GRNA兼容的矢量，请使用可变的链接器PGG-F-a-aari-sacb-aari-g-g（请参阅补充数据集1中的可变链接器）。由于我们的克隆策略使用限制酶Bsai和Aari，因此要求所有向量都需要无BSAI和AARI-FIME（除了克隆位点）。
单次静脉注射合成外泌体递送的 CRISPR 基因后，成功将阿尔茨海默病模型小鼠脑中的载脂蛋白 E4 编辑为 E3
图 1 . ApoE4 gRNA 变体、PAM 位点和 E4 ARG 到 E3 CYS 的碱基编辑。（A）显示的是 gRNA #1 和 #2，它们以 APOE4 序列“C”为目标，并分别在位置 #8 和 #5 处将其与胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶编辑窗口对齐（框出）。密码子 112 中的“C”到“T”碱基编辑导致 ARG 到 CYS 替换，从而产生 ApoE3。（B）显示了 CBE（Cas9n、evoAPOBEC1 和 UGI）、E4 特异性 gRNA 和 sgRNA 以及 ApoE4 基因复合物。目标胞嘧啶“C”显示在胞嘧啶脱氨酶 evoAPOBEC1 酶附近。选择了两个候选 CBE，pBT375 和 pYE1BE4max，34 进行合成和测试，
Temple University CRIS/CAS9生物安全指南
病毒输送，CAS9和GRNA是否会在单个转移载体/质粒或单独的转移载体/质粒上一起传递（因为它可以赋予更大的安全性）？使用相同病毒载体交付Cas9和GRNA的情况，如果有可能使一个或多个人类肿瘤抑制基因失活的话，可能会给实验室工人带来额外的风险。请考虑因这种风险而意外暴露的任何潜在风险，并证明您的实验设计是合理的。
